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当归提取物的鉴定及镇痛活性观察
【摘要】 目的 鉴定当归提取物的主要化学成分，并观察其镇痛作用。方法 采用Molish反应和Fehling实验反应对当归提取物进行鉴定，苯酚硫酸法测定其糖含量;采用小鼠扭体法和热板法观察当归提取物的镇痛作用。结果 当归提取物的主要成分为多糖，其糖含量为%，此提取物可明显抑制醋酸所致小鼠扭体反应，提高小鼠痛觉反应的痛阈。结论 此当归提取物主要成分为多糖，具有明显的镇痛作用。
【关键词】 当归提取物;鉴定;多糖;镇痛作用
　　ABSTRACT ：Objective To identify and analyze the main composition of Angelica Sinensis extract and to investigate its analgesic　The identification test was processed with Molish test and Fehling test, the polysaccharide content analysis was processed by phenolsulfuric acid reaction. The analgesic effect was investigated by acetic acid—induced wringing test and hotplate procedure in　The main composition of Angelica Sinensis extract was polysaccharide, the polysaccharide content of Angelica Sinensis extract was %. The frequency of wringing reaction induced by acetic acid was obviously decreased, and the pain threshold of mice in the hotplate procedure was increased after the animals were administered with Angelica Sinensis　The result indicates that the main composition of Angelica Sinensis extract is polysaccharide, and it possesses significant analgesic effect.
　　KEY WORDS：Angelica Sinensis extract; Identification; Polysaccharide; Analgesic effect
　　当归Angelica Sinensis (Oliv.) Diels是祖国医学中最常用的中药材之一，可用于活血通经、虚寒腹痛，亦可治跌打损伤。当归在历代方剂中应用频度极高，已被证明具有复杂的生物活性[1~3]。我们从当归中提取到一种组分，对其主要成分进行了初步鉴定，并观察了其镇痛作用。
　　1 材料和方法
　　仪器与药品
　　Savant ecs100UVS400A 冷冻真空干燥机;RB200智能热板仪，成都泰盟科技有限公司。葡萄糖对照品，Amresco。阿司匹林片，昆明制药厂，临用前取研碎后配制成12g/L的浓度。
　　实验动物
　　昆明小鼠50只，雌性，体质量20±2g，购于湖北省医学科学院。
　　当归提取物的制备
　　当归100g，切片，乙醇回流后100℃沸水提取，提取液60℃减压浓缩至60ml，加入95%乙醇3200ml，充分搅拌，-20℃静止48h后取上清，用乙酸乙酯萃取，收集水相，上大孔树脂柱，分别用甲醇、乙醇、水过柱，收集水洗脱组分，60℃减压浓缩后加入适量丙酮，4000rpm离心10min，收集沉淀，用水溶解后挥去溶剂，活性炭过滤，滤液-80℃冰箱预冻2天后于冷冻干燥机冷冻至干燥。
　　试剂制备
　　(1)Fehling试剂： CuSO4加水定容至，普通滤纸过滤;酒石酸钾钠与加水定容至，普通滤纸过滤。临用前两滤液等体积混合。
　　(2)5%苯酚试剂：取苯酚，加铝片和，蒸馏，收集182℃馏分，称取，加水150ml溶解，置棕色瓶内冷藏备用。
　　(3)当归溶液：取冻干的当归提取物，分别配成/L、/L、/L的溶液，115℃灭菌30min后备用。
　　当归提取物的鉴定
　　(1)Molish反应：取当归提取物，加水溶解，加2滴15%α萘酚乙醇溶液，混合摇匀后，沿管壁缓缓加入硫酸，将试管静置10min后50℃水浴5min观察在两液面交界处有无紫红色环出现。
　　(2)Fehling实验：取当归提取物，加水定容至200ml，取置试管中，加5%盐酸液，沸水水浴15min，室温静止至冷，加酚酞指示剂1滴，用10%NaOH试液中和至中性，加Fehling试剂4～5滴，50℃水浴5min，观察是否生成棕红色沉淀。
　　多糖含量测定
　　按照文献方法，精密称取105℃干燥至恒重的葡萄糖标准品120mg，加水定容到100ml，得/ml葡萄糖贮备液，分别精密吸取葡萄糖贮备液、、、、、，定容至100ml，摇匀，分别吸取上述标准葡萄糖溶液, 加入10ml试管中, 加入5%苯酚溶液，旋涡混匀, 迅速滴加浓硫酸5ml，旋涡混匀，60℃水浴加热20min，室温冷却，另取1ml蒸馏水作空白对照，在490nm波长处测定吸光值。
　　精密吸取当归提取物，用蒸馏水溶解定容至100ml，取该溶液100μl加入900μl蒸馏水使样品液为1ml，加5%苯酚溶液，旋涡振荡，迅速加浓硫酸，旋涡振荡，60℃水浴20min，取出冷却至室温，于490nm处测定吸光度值。代入标准曲线求出当归提取物中总糖含量。
　　当归提取物的镇痛作用
　　(1)当归提取物对醋酸致小鼠扭体的影响。小鼠随机分成5组，空白组，阳性对照组，低剂量当归提取物组及中、高剂量组，每组10只。低、中、高剂量当归提取物组分别腹腔注射9g/L、18g/L、36g/L的当归提取物溶液，阳性对照组按照300mg/kg给予阿斯匹林灌胃，空白组给予等量NS腹腔注射，给药1h后，每只小鼠腹腔注射%醋酸溶液，记录15min内小鼠扭体反应次数。
　　(2)当归提取物对小鼠痛阈的影响。以热板测痛仪测定动物在(±)℃的基础痛阈，低于10s或高于30s以及入仪器跳跃的小鼠剔除不用，记录动物放至热板上至动物出现舔足反应的时间记为基础痛阈。各组小鼠给药1h后测定动物痛阈，若动物60s内未出现舔足反应，痛阈记为60s。
　　2 结 果
　　当归提取物的鉴定结果
　　Molish反应：试液中有明显紫红色环出现，提示此当归提取物中含有糖类物质。
　　Fehling实验：试液中生成棕红色沉淀，提示当归提取物中含有糖类物质。
　　当归提取物糖含量测定
　　以葡萄糖含量为横坐标, 吸光度值为纵坐标, 得回归方程为：A=+ (r=),线性范围6～60μg/ml，标准曲线如图1。将当归提取物溶液的OD490值代入回归方程，求得当归提取物的糖含量为%。
　　当归提取物的镇痛作用
　　热板法观察当归提取物对小鼠痛阈的影响，结果显示高剂量当归提取物可明显提高小鼠对热刺激致痛的痛阈()，痛阈提高百分率为%，中剂量当归提取物虽可提高小鼠对热刺激致痛的痛阈(痛阈提高百分比为%)但给药前后配对检验，不具有统计学意义。阿司匹林对动物痛阈提高率百分比为%，900mg/kg的当归提取物对动物痛阈提高率虽较阿司匹林为高，但此两组的组间比较没有显着性差异，结果见表1。表1 热板法观察当归提取物对小鼠痛阈的影响
　　当归提取物对小鼠扭体反应的影响
　　中、高剂量当归提取物可明显减少醋酸所致的小鼠扭体次数()，高剂量当归提取物的扭体抑制率为%，接近阿司匹林(%)，高剂量当归提取物的抑制率虽高于中剂量当归提取物组，但无统计学意义(P=)。低剂量的当归提取物并未对动物的扭体反应产生明显影响。结果见表2。表2 当归提取物对醋酸所致小鼠扭体反应的影响与空白组比较，*，**
　　3 讨 论
　　多糖是广泛存在于自然界的天然高分子化合物，由单糖通过糖苷键连接而成。根据植物多糖溶于水、遇乙醇沉淀的性质采用水提醇沉法提取植物多糖是最常用的提取方法[5~7]。从当归中提取多糖常用的方法是乙醇处理当归水提液，在水提液中含醇量达到80%时，几乎可除去全部的蛋白质和多糖、无机盐类，对所得沉淀中进行纯化、分离，即可获得当归总多糖(或称当归粗多糖)。
　　本文所涉及的当归提取物为当归水提液经乙醇处理(含醇量80%)后的上清中提取到的组分，此提取物在Molish反应中的二层界面出现紫色环，在Fehling实验中生成了棕红色沉淀，均提示此当归提取物中含有糖类物质。
　　提取当归多糖时乙醇浓度一般控制在60%～80%,不同提取、分离方法从当归水提醇沉的沉淀中获得的当归多糖组分的化学属性存在很大差别。本文的当归提取物来源于当归水提组分中可溶解于80%的乙醇溶液的部分，而非来源于当归醇沉物，实验结果提示在传统的水提醇沉法的上清液中仍含有多糖组分，这一部分当归多糖组分的分子量、单糖组成等化学属性以及药理学活性与来自于醇沉的沉淀中的多糖组分是否存在差别，尚待进一步研究。
　　实验结果表明此当归提取物能明显提高小鼠对热刺激致痛的痛阈，抑制小鼠对化学刺激致痛的扭体反应。有研究报道从水提醇沉的沉淀中得到的当归总多糖也具有镇痛效应，当归中的这两个组分的药理学活性是否存在差异，镇痛机理如何，尚待进行相关实验研究比较。
【参考文献】
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