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Restin基因启动子的克隆及其在HeLa细胞中的转录活性
【摘要】 目的：扩增细胞静息因子(restin)基因启动子并构建该启动子的荧光报告系统，探讨其对全反式维甲酸(alltrans retinoic acid, ATRA)刺激的反应. 方法：①对restin基因上游约2000 bp基因组序列进行计算机生物信息学分析. ②利用PCR技术扩增restin基因上游序列，将其克隆入pG5luc中，插入荧光素酶报告基因上游，取代5个GAL4结合位点及腺病毒启动子，构建Rpluc质粒. ③将构建的质粒转染入HeLa细胞，ATRA诱导检测该质粒中荧光素酶的表达. 结果：酶切及测序结果均证实成功克隆了restin基因上游序列，已将该序列插入到荧光素酶基因的上游；ATRA诱导转入HeLa细胞中的真核表达载体Rpluc，荧光素酶表达明显增加. 结论：成功构建了含有restin基因启动子序列的荧光报告系统，为进一步研究restin基因功能及其转录调控奠定了基础.
　　【关键词】 restin；转录调控；启动子；全反式维甲酸
　　0引言
　　细胞静息因子(restin)基因是在全反式维甲酸诱导的肿瘤细胞中差异表达的基因之一，属于黑色素瘤相关抗原家族，将其导入白血病细胞可以抑制细胞增殖［1-2］. 路凡等［3］认为可以将MAGE家族分为酸性MAGE蛋白和碱性MAGE蛋白. 有意义的是碱性MAGE蛋白在终末分化细胞和生殖细胞中表达，而在肿瘤细胞中不表达或低表达，而酸性MAGE蛋白则在终末分化细胞中不表达，只表达在肿瘤细胞和生殖细胞中. 同时在ATRA诱导的肿瘤分化细胞中，表现出酸性MAGE蛋白降低和碱性MAGE蛋白升高，restin正好也为碱性MAGE蛋白. 组织表达谱分析表明restin主要表达在正常终末分化组织，而在肿瘤组织中不表达或表达量极低［4］. 因此，研究restin的表达调控不但可以增强对restin的作用机制的理解，同时也可促进对肿瘤细胞分化控制机制的了解. 我们根据生物信息学分析结果的提示，从胎儿肌肉基因组DNA中扩增得到含预测启动子区和调控元件restin基因翻译起始位点上游约2000 bp DNA序列，并利用KpnI 酶切位点和NcoI酶切位点将扩增序列导入荧光报告载体pGL5Luc中，取代5个GAL4结合位点及腺病毒启动子，然后将构建好的质粒转入HeLa细胞中检测ATRA诱导前后转录活性，为研究该基因的转录调控及功能奠定基础.
　　1材料和方法
　　材料
　　大肠杆菌菌种DH5α和HeLa细胞为第四军医大学生物化学与分子生物学教研室保存；限制性内切酶、pyrobest酶、pMD18T Vector；脂质体Lipofectamine 2000及1640培养基；新生牛血清；DL2000 marker；琼脂糖凝胶回收试剂盒及产物纯化试剂盒超纯去内毒素质粒提取试剂盒； TM 组织DNA提取试剂盒；ATRA；双荧光报告系统及照度计TD20/20检测仪；寡核苷酸引物合成及测序由三博生物技术公司完成.
　　方法
　　基因5′端上游序列的生物信息学分析利用NCBI基因组数据库查找restin基因5′端上游序列，使用McPromoter promoter prediction server软件进行启动子预测，Vector NTI分析部分转录因子结合位点(100%匹配).
引物设计与合成设计引物：上游引物引入KpnI酶切位点5′ac ggt acc gcc cta cgt ttg aga tta agt cgc3′, 下游引物引入NcoI酶切位点5′cga gcc atg gct cct gat aga ggc tc3′.
　　基因组DNA提取提取人胎儿股部肌肉组织基因组DNA，按照试剂盒提供的操作手册进行操作.
　　扩增启动子提取的基因组DNA稀释10倍后取1 μL作为PCR反应模板，反应体系为：引物400 nmol/L，dNTP 200 μmol/L, pyrobest酶1 U; 反应参数为：95℃ 30 s, 58℃ 20 s, 72℃ 120 s, 30个循环.
　　扩增产物的克隆及鉴定扩增产物经试剂盒纯化回收，再用Taq酶1 U，dATP 200 μmol/L，72℃ 30 min加入多聚A尾, 产物琼脂糖凝胶电泳纯化回收后，将片段连入pMD 18T Vector载体，转化. 以上过程均参照文献［5］进行，转化的菌液铺制在含IPTG和Xgal的Amp抗性的LB琼脂平板上培养，利用α互补原理，通过蓝白斑筛选出重组子. 经 KpnI 和 NcoI双酶切鉴定出有插段的阳性克隆及方向. 挑选阳性克隆提取质粒，做测序反应.
　　荧光报告质粒Rpluc的构建KpnI和NcoI双酶切pG5luc质粒的GAL4 结合区域，将测序结果正确的片段与pG5luc连接，构建荧光报告质粒Rpluc.
　　荧光报告系统转录活性检测含2 mmol/L谷氨酰氨和100 mL/L FBS的1640培养液常规培养HeLa细胞. 在转染前1 d将细胞接种于24孔板，37℃, 50 mL/L CO2孵箱培养细胞至次日80%~90%铺满时进行转染. 每孔转入质粒Rpluc　μg; pBind　μg. 转染4～6 h后，换为含1×10-6 mol/L ATRA的完全培养基继续培养，以不加ATRA者作阴性对照.
　　荧光素酶的检测继续培养24 h后小心吸去孔中的培养基，加入足量的PBS洗涤培养孔，每孔中加入100 μL 1×PLB，室温摇动孵育15 min，充分溶解转染细胞, 吸取细胞裂解液转移至 mL离心管中，13 000 g离心5 min, 吸取上清液. 按照双荧光报告系统的说明书进行操作，分别检测得到萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶的荧光值，二者的比值即为相对荧光表达量，代表启动子的活性. 每组实验至少重复3次，取平均值.
　　2结果
　　转录因子结合位点和启动子预测结合文献报道的与凋亡和ATRA相关的转录因子的结合位点，对restin基因上游序列进行比对分析发现：该序列中含有一个p53结合位点aagacaagctt和一个C/EBP结合位点ttgcttaa；三个GAS结合位点,依次是ttcctggaaa，ttctcagaat，ttccaagaat. 启动子预测分析发现restin基因上游2000 bp存在三个可能的启动子区.
　　荧光报告质粒构建以提取的基因组DNA为模板，扩增出restin基因上游序列，大小为2170 bp,克隆入pG5luc载体，命名Rpluc. 酶切鉴定如图1所示.
　　荧光报告系统转录活性检测ATRA刺激转染荧光报告质粒Rpluc的Hela细胞后，荧光素酶活性测值明显增加，表明所构建的restin基因启动子报告系统有转录活性.
　　3讨论
　　随着新基因不断被发现，目前已知的基因数量越来越多，在对新基因结构与功能的研究中，最重要的内容之一就是基因的表达调控. 阐明基因表达调控的机制，不但可以深入了解疾病发生的原因，而且对于基因治疗的研究也具有十分重要的意义. 启动子区的克隆是对基因表达调控进行研究的必要条件，通过启动子研究，许多新基因功能及其在信号传导中的地位渐被认识. restin基因是ATRA诱导肿瘤细胞分化克隆得到的差异表达基因之一，该基因的表达特征和表达水平是如何受到调控的值得深入研究.
　　克隆新基因的启动子是对研究基因表达调控和构建表达载体至关重要. 对于已知基因序列清楚的情况下首先采用的就是PCR法. PCR法的主要优点是简便、快捷、操作简单；其缺点是只能扩增两端已知序列间的DNA区，且扩增的特异性较低. 其适用条件是建立在对基因序列十分清楚的基础上，只有知道基因的全序列，才可根据已知序列设计引物，扩增出该基因的启动子. 设计引物之前，应用生物信息学的方法通过软件预测，对 restin基因翻译起始位点上游约2000 bp DNA序列进行分析，结果发现其中含三个可能的启动子区域，以及p53，C/EBP，STAT等转录因子的结合位点. ATRA是经典的诱导肿瘤细胞分化剂，restin是通过ATRA分化诱导的差异表达基因，我们选择了荧光报告载体构建了带有restin基因启动子的荧光报告质粒(Rpluc)，确定该报告系统在ATRA诱导分化的HeLa细胞中有转录活性，并且可以作为研究restin基因转录调控的重要工具；我们的研究结果证明该构建启动子报告系统的方法是可行的, 为研究其他新基因的启动子转录调控机制提供了一种准确可靠的荧光报告系统的构建方法，并且该启动子的转录活性受ATRA调控. 为下一步研究不同截短体启动子区域的活性和确定转录调控结构域、深入研究转录调控机制奠定了基础.
　　【参考文献】
　　［1］ Zhao ZL, Huang X, Li N, et al. Direct cloning of cell differential expression genes with fulllength by a new strategy based on the multiple rounds of "long distance" PCR and magnetic beads mediated subtraction ［J］. J Biotech, 1999, 73: 35-41.
　　［2］ Zhu F, Yan W Zhao ZL, et al. Improved PCRbased subtractive hybridization strategy for cloning differentially expressed genes ［J］. J Biotech, 2000, 29(2): 310-313.
　　［3］ 路凡，杨辉，王孝功，等. 碱性MAGE家族新成员restin在大肠杆菌中的表达和抗体制备［J］. 细胞与分子免疫学杂志, 2005, 21(3): 309-311.
　　［4］ Zhao ZL, Lu F, Zhu F, et al. Cloning and comparative biology study of Restin, a novel member of MAGE superfamily ［J］. Sci China (Series C), 2002, 45(4):412-420.
　　［5］ Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T(金东雁，黎孟枫译). 分子克隆实验指南 ［M］. ２版. 北京: 科学出版社,1992: 16-68.
　　［6］ Salvtore S, Anrea O, Luca L, et al. Cloning of the mouse insulin receptor substrate3 (mIRS3) promoter, and its regulation by p53 ［J］. Mol Endocrinol, 1998, 16(7):1577-1589.
　　［7］ Kong XT, Gao HX, Eric J. Mechanisms of differential activation of target gene promoters by p53 hinge domain mutants with impaired apoptotic function ［J］. J Biol Chem, 2001,(276): 32990-33000.
　　［8］ Golubovskayaa V, Kaura A, Cance W. Cloning and characterization of the promoter region of human focal adhesion kinase gene: Nuclear factor kappa B and p53 binding sites ［J］. Biochim Biophys Acta, 2004, 1678(23):111-125.