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反相高效液相色谱法测定岩黄连药材中岩黄连碱的含量
【摘要】 目的建立岩黄连药材中岩黄连碱的含量测定方法。方法采用反相高效液相色谱法，以乙腈∶水为流动相，流速为1 ml/min, 检测波长为347 nm，柱温20℃，进样量为20 μl,外标法计算含量。结果岩黄连碱在 4～ μg内峰面积与对照品的进样量呈良好的线性关系，其回归方程为 Y=2×106X-5 (r= 98)。平均回收率分别为%,%,%，RSD分别为%，%，% 。结论所建立的RP-HPLC含量测定方法简便、准确、专属性强、重现性好。为控制药材岩黄连质量标准提供了依据。
【关键词】 岩黄连碱 反相高效液相色谱法
　　AbstractObjectiveTo develop a new method for determination of the content of dehydrocavidine in Corydalis saxicola　content of dehydrocavidine in C. saxicola Bunting was determined by RP-HPLC，using acetonitrile-water(V∶V＝50∶50, ％ potassium dihydrogen phosphate and % sodium lauryl sulfate ) as mobile phase,1 ml/min, with 347 nm of detection wavelength, the temperature was 20℃. The injection volume was 20 μl and the external standard was used. ResultsThe linear range was within　4～ μg and the correlation cofficient was　average recovery and RSD were %，%，%and %，%，%,　method is simple, accurate, specific and precised. It is suitable for the the quality control of the Corydalis saxicola Bunting.
　　Key words：Dehydrocavidine; RP-HPLC

　　岩黄连Corydalis saxicola Bunting，又名石生黄堇，紫堇科紫堇属多年草本植物［1～3］。具有显着的抗菌、消炎、镇痛和安定作用，是桂西北山区常用消炎止痛、排毒、 治疗急慢性肝炎和肝硬化等疾病的一种中草药［2，3］，其化学成分含有［4］：脱氢卡维丁(dehydrocavidine),小檗碱，(±)cavidine±)thalictrifoline,dehydrocavidine，(-)13β-hydroxystilopine，(+)四氢巴马汀［(±)tetrahydropalmatine］，(-)斯库来碱［(-)scoulerine］，白屈菜红碱，(-)四氢非洲防己胺［(-)tetrahydrocolumbamine］，原阿片碱,卡维丁,延胡索甲素等多种生物碱，其主要活性成分为岩黄连碱，生物碱含量高低直接影响药材质量和疗效。岩黄连植物分布局限于石灰岩山区，属石山特有种［3］。目前，国内外对岩黄连的研究主要集中在岩黄连总生物碱的成分分析［5］ ，引种栽培［2～6］和药理作用［7～10］的研究，而对不同地区的岩黄连中岩黄连碱含量差异的研究未见报道。本实验主要建立了岩黄连中岩黄连碱含量测定方法，并对不同地区的岩黄连中岩黄连碱含量进行测定，为岩黄连质量考查提供参考，这对于指导岩黄连的标准化种植及合理采收具有重要意义。
　　1 仪器与试药
　　仪器LC-9000D高效液相色谱仪，Sartorius ME215S(德国赛多利斯)电子天平，B3200S超声处理器, RE-52A型旋转蒸发仪。
　　试剂乙腈(色谱纯, 美国TEDIA公司,Lot 506126), 甲醇(色谱纯, 天津四友生物医学技术有限公司)，磷酸二氢钾，十二烷基硫酸钠，水为高纯水， HCl,氨水，氯仿。
　　试药岩黄连碱对照品；药材岩黄连供试品。
　　2 方法与结果
　　色谱条件与系统适用性实验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，乙腈∶水为流动相，检测波长为347 nm，理论塔板数按岩黄连碱峰计算应不低于6 000。
　　对照品溶液的制备 准确称取岩黄连碱对照品适量，精密称定，加流动相制成每毫升含25μg岩黄连碱的溶液，即得。
　　供试品溶液的制备取本品约10 g，剪碎，加入20倍量1％HCl溶液，煎煮30 min，取水提液，药渣再重复上一步骤，过滤，合并两次水提液，加氨水调pH至10，析出沉淀，过滤得清膏，80℃干燥2 h，加入20倍量氯仿回流提取30 min，过滤，得黄绿色澄清液体，将滤液减压蒸馏，挥干氯仿，精密加入 ml流动相超声溶解， μm微孔滤膜滤过，取续滤液，稀释25倍(取1 ml用流动相定容至25 ml容量瓶)，即得。
　　阴性对照溶液的制备以项的流动相为阴性对照溶液。
　　阴性干扰实验精密吸取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液各20 μl注入液相色谱仪中，色谱图见图1。由色谱图可知，在与对照品色谱峰保留时间相应的位置上，供试品溶液具有相同保留时间的色谱峰出现，而阴性液在此峰位无吸收，对本品中岩黄连碱的测定无干扰。
　　标准曲线的制定称取岩黄连碱 mg，置10 ml量瓶中，加流动相使溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品贮备溶液。吸取上述对照品贮备溶液 ，，，，　ml，分别置 ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，分别作为对照品溶液(浓度分别为，，，， μg/ml）, 按色谱条件分别进样测定(进样量20 μl)。以岩黄连碱对照品进样量(μg)为横坐标(X)，峰面积积分值为纵坐标(Y)，绘制标准曲线，则回归方程为：

　　Y=2×106X-5 (r= 98)

　　结果表明：当进样量在 4～ μg范围内时，岩黄连碱进样量与峰面积呈良好的线性关系。结果见表1。标准曲线见图2。
　　图1 对照品、供试品和阴性对照品的HPLC图
　　表1 线性关系
　　图2 标准曲线
　　精密度实验取 “”项下对照品，分别连续测定6次，结果岩黄连碱峰面积值的RSD小于 2 %。结果见表2。实验表明，本法的精密度良好。
　　表2 精密度实验结果
　　重复性实验 精密量取同一供试品(东兰县隘洞镇拉板村)9份，按“”项方法操作，分别进样20μl，测得岩黄连碱色谱峰面积，计算RSD。结果见表3。
　　表3 重复性实验
　　稳定性实验取同一份供试品溶液(东兰县隘洞镇拉板村)，每隔一定时间测定1次，共测定5次。结果见表4。实验表明，在12 h内，供试品溶液稳定。
　　表4 稳定性实验结果
　　加样回收率实验称取岩黄连碱对照品约10 mg，精密称定,置 50 ml量瓶中，加甲醇使溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。按“”项下方法制备已知含量样品(东兰县隘洞镇拉板村)，分别加入上述岩黄连碱对照品溶液，， ml，按拟订的方法制备供试品溶液，共平行制备9份，分别进样测定，按下式计算回收率。结果见表5。

　　回收率=测得量-样品量加入对照品量×100%
　　表5 加样回收率实验结果
　　含量测定分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，即得。结果见表6。
　　表6 岩黄连药材含量测定
　　3 讨论

　　本实验采用岩黄连碱为季胺类生物碱，极性较大，用普通的离子抑制色谱法无法达到良好的分离。因此采用了离子对色谱法，加入十二烷基硫酸钠作为离子对试剂，抑制其解离，能达到良好的分离效果。最后我们发现以乙腈－水为流动相，改变流动相配比进行最佳流动相的选择，结果表明，岩黄连碱在乙腈∶水为流动相与相邻组分峰分离度R1．5，达到分离要求，能完全满足色谱峰定量要求。

　　不同产地药材含量测定结果表明，东兰县达文村示范基地所产岩黄连中岩黄连碱含量最高，东兰县隘洞镇拉板村所产含量次之，而东兰县兰木乡同仕村所产含量最低。

　　本实验采用经典的酸提碱沉法提取岩黄连中岩黄连碱，制成清膏后采用甲醇、醋酸乙酯和氯仿进行回流提取，结果发现用氯仿回流其提取率大于用乙醇、醋酸乙酯提取，最后采用了氯仿作为提取溶剂。
【参考文献】
　　［1］ 何金祥．岩黄连茎基腐病的分离鉴定及防治［J］.广西植物，2003,23(5)：473．
　　［2］ 蒋水元，胡兴华，赵瑞峰．岩黄连引种栽培研究［J］.广西植物，2002，22(5)：469．
　　［3］ 文和群，许兆然，，等．中国南部石灰岩稀有濒危植物名录［J］.广西植物，1993，13(2)：110．
　　［4］ 柯珉珉．岩黄连有效成分的研究［J］.药学通报，1980：15(6)：41．
　　［5］ 柯珉珉，张宪德，吴练中，等．岩黄连有效成分的研究［J］.植物学报，1982，24(3)：289．
　　［6］ 陈祖强．广西栽培与野生岩黄连的质量比较研究［J］.广西植物，1993，13(2)：188．
　　［7］ 陈重阳，赵 一.岩黄连脱氢维丁药理研究［J］.中药通报，1982，7：31.
　　［8］ 叶琦莉，吴练中，李 辉，等.岩黄连的主要成分脱氢卡维丁的抗菌实验［J］.广西中医药，1984，7：48.
　　［9］ 黄燮南，刘国雄，张 毅，等.岩黄连总生物碱的安定作用［J］.中国药理学报，1981，2：156.
　　［10］ 韦记青，蒋水元，蒋运生，等.药用植物岩黄连研究概述［J］.广西科学院学报，2006，22：108.