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CD133抗原在白血病及MDS骨髓细胞中的表达

　　作者：王伟，汪洪毅，赵会霞，崔中光，李广伦
【摘要】 　　为了探讨CD133抗原与白血病和骨髓增生异常综合症发病的关系， 采用免疫细胞化学方法检测CD133抗原在白血病和MDS中的表达。结果显示， 43例急性白血病患者CD133表达的阳性率为％, 急性髓系白血病组CD133的表达与对照组间的差别有统计学意义，慢性髓系白血病的CD133表达阳性率与对照组间的差别无统计学意义。9例MDS患者中有5例呈CD133表达阳性，阳性率为％, 与对照组相比无显着差异。在所有白血病患者中CD34+患者的CD133表达率高于CD34-患者，且差异有统计学意义。CD133表达与性别、年龄、骨髓白血病细胞比例、外周血原幼细胞比例、外周血白细胞数、血红蛋白、血小板数及乳酸脱氢酶水平无显着相关性。结论： AML患者骨髓细胞CD133表达高于正常对照，CD133表达与CD34表达有相关性。CD133高表达可能是急性白血病不良预后的一个因素。
【关键词】 白血病； MDS； CD133； CD34； 预后
　　Expression of CD133 in Bone Marrow Cells of Patients with Leukemia and Myelodysplastic Syndrome
Abstract To explore the relationship between the expression of CD133 and pathogenesis of leukemia and MDS, immunocytochemistry method was used to examine the expression of CD133 in bone marrow cells of patients with leukemia and MDS. The results showed that the positive rate of CD133 in 41 acute leukemia patients was %. The expression of CD133 in AML patients (16/29,%) was significantly higher than that in control group (2/15,%). There was no significant difference in CD133 expression between CML and control　positive rate of CD133 in 9 patients with MDS was %(5/9). There was no significant difference between MDS and normal control. The expression of CD133 in all leukemia cells with CD34+ was higher than that in leukemia cells with CD34-, and there was significant difference in expression of CD133 between them (). The expression of CD133 had no relationship with the clinical prognostic factors such as sex, age the percentage of leukemic cells in peripheral blood and in bone marrow, WBC counts, hemoglobin concentration, platelet counts and LDH level. It is concluded that the expression of CD133 in bone marrow cells of patients with AML is higher than that in control group. The expression of CD133 is significantly correlated with the expression of CD34. The high expression of CD133 may be an adverse prognostic factor in acute leukemia.
Key words leukemia; MDS; CD133; CD34; prognosis
J Exp Hematol 2007; 15(3):470-473
CD133曾被认为仅仅是一种造血干／祖细胞表面标记。1997年Yin等［1］首次报道了AC133抗原并成功制备了能识别该抗原的单克隆IgG抗体，2000年6月第七届人类白细胞分化抗原工作组会议(ILDAW)将此抗原命名为CD133［2］。文献报道，CD133+CD34+的造血干/祖细胞较之CD133-CD34+造血干/祖细胞有更强的多系分化潜能［3］,从而为白血病的造血干细胞移植提供新的策略。本研究通过免疫细胞化学方法分析CD133抗原在白血病和骨髓增生异常综合症中的表达及其与CD34的协同表达以了解其临床意义。
材料和方法
标本采集与处理
急性白血病患者43例，其中初治患者36例，治疗后复发患者7例;AML 29例，ALL 14例。AL中男22例，女21例，年龄12-80岁。慢性白血病患者9例，其中男8例，女1例，年龄34-82岁。骨髓增生异常综合症患者9例，其中男6例，女3例，年龄15-76岁。以上患者均为2004年3月20日-8月10日在我院血液病研究室确诊的病人。另取非血液系统恶性疾病患者15例作为对照，对照组与病例组在性别、年龄上无显着差异。
中国实验血液学杂志 J Exp Hematol 2007; 15(3)CD133抗原在白血病及MDS骨髓细胞中的表达取以上患者骨髓2 ml，常规肝素抗凝，淋巴细胞分离液分离出单个核细胞， 895×g离心20分钟。离心后液体分3层，上层为血浆，中层为分层液，下层为红细胞，在上层与中层交界面呈现浑浊带，此层含有大量单个核细胞。用毛细吸管轻插至白膜层，沿管壁周缘吸出界面层细胞，移入另一无菌刻度离心管中。用5倍以上体积的PBS洗涤， 671×g离心10分钟,去上清液。重复洗涤3次，然后计数活细胞，使细胞浓度控制在107/ml左右。用离心涂片机离心涂片，晾干，冷丙酮固定，-20℃冰箱保存备用。
主要试剂
CD133单克隆抗体购自R&D公司，CD34单克隆抗体购自Zymed公司，SP kit试剂盒购自天津灏洋公司和北京中杉金桥生物技术有限公司，浓缩型DAB试剂盒购自天津灏洋公司。
方法
免疫细胞化学方法严格按试剂盒说明书进行。
阳性细胞判定标准
阳性细胞的胞膜呈棕色或棕黄色颗粒，观察者记数200个细胞，结果用半定量记分方法判定，即①按阳性细胞占细胞总数的多少分为0-3级，0级：阳性细胞为0； 1级：阳性细胞＜25％； 2级：阳性细胞＜50％； 3级：阳性细胞＞50％； ②按着色细胞染色强弱分为0-3级，0级：弱；2级：中；3级：强。然后以两项积分之和判断阳性程度，"0-2分"为阴性染色，"3-6分"为阳性染色。
统计学处理
两样本率的比较采用χ2检验。结 果
急性白血病患者骨髓细胞CD133表达
43例AL患者CD133表达的阳性率为％。29例AML患者中，16例CD133表达阳性,阳性率为％，其中AMLM1 1例，AMLM2 5例，AMLM3 1例，AMLM4/M5 7例，MDS转化的AML 2例(2/2)。14例ALL患者中有6例CD133表达阳性，8例CD133表达阴性，CD133表达的阳性率为％。AML组CD133的表达与对照组间的差别有统计学意义，AML与ALL组之间CD133表达的差别无统计学意义()。对AML各FAB亚型CD133表达率的差异的统计学分析显示，M4/M5亚型的CD133表达率高于M3，差异有统计学意义，其余各亚型之间的差异均无统计学意义。
初治组CD133表达阳性率低于AL治疗后复发组CD133表达阳性率，但差异无显着性。
慢性白血病患者骨髓细胞CD133表达
9例慢性白血病患者中，6例CML患者中CD133表达阳性者2例，2例CLL和1例CNL中均未检测到CD133表达。但CML阳性率与对照组间的差别无统计学意义。
MDS患者骨髓细胞CD133表达
　　9例MDS患者中有5例CD133呈阳性，4例为阴性，阳性率为％,与对照组间的差别无显着差异。
患者骨髓细胞CD133与CD34的协同表达
所有病例CD34阳性与CD34阴性患者CD133表达情况见附表。
Table. Expression of CD133 in bone marrow cells with either CD34 positive and CD34 negative in patients with acute leukemia and MDS
CD133 positiveCD133 negativeCD34 positive23*16CD34 negative616*， compared with CD34 negative patients.
对白血病患者骨髓细胞分析发现，在CD34+与CD34-患者均可表达CD133,在所有白血病患者中CD34+组的CD133阳性表达率高于CD34-患者，且差异有统计学意义，但分析显示CD34+AML与CD34-AML病人CD133表达率的差异无显着性，在ALL组也如此。
此外，我们的研究分析还表明，骨髓细胞CD133的表达与性别、年龄、骨髓白血病细胞比例、外周血原幼细胞比例、外周血白细胞数、血红蛋白、血小板数及乳酸脱氢酶高低无显着相关性。
讨 论
CD133是一种非常保守的蛋白，从线虫到人都有很高的同源性［4］。CD133在正常及异常造血和非造血组织中均有表达，随着细胞的分化成熟其表达减弱、消失。研究发现，两个人体视网膜母细胞瘤细胞系、WERIRb1和一个畸胎瘤细胞系NT2的CD133表达为阳性，AML来源的细胞系MUTZ2是第一个已知的人CD133+造血细胞系［6］。1997年，Miraglia等［5］首次报道急性白血病患者CD133的表达情况，11例CD34+患者中CD133高表达3例，弱表达4例。之后，Horn等［7］对30例AML患者CD133的表达进行了检测，结果9例CD133bright,15例CD133dim,6例CD133-,与Miraglia不同的是，CD133在AML包括原发性和MDS转化的继发性白血病各个FAB亚型中均有表达，而且表达强弱程度与FAB亚型无关。
与Horn的报道类似,我们的研究结果显示，CD133表达在AML及ALL患者骨髓细胞均可阳性，而在AML及ALL组CD133阳性表达率均高于对照组，且AML组与对照组间的差异显着，但ALL组与对照组间差异无显着性，AML组与ALL组间CD133阳性表达率的差异也无统计学意义。考虑到ALL组病例数较少，故不能判定CD133在ALL的表达无意义，有待增加病例数作进一步研究。与Miraglia等［5］不同的是，在我们的研究中CD133可表达于各FAB亚型，各亚型表达率M1为100％,M2为％，M3为％，M4/M5为％,这一点与Horn等［7］研究类似。经统计学分析M4/M5病例组的CD133表达率高于M3病例组，且差异有统计学意义，其余各亚型之间的差异均无统计学意义。故CD133并非特异性的表达于AML的某一FAB亚型，检测CD133不能作为 FAB亚型的鉴别依据。
一些研究表明，CD133表达与CD34表达有相关性。如Lee等［8］发现，所有的CD133+白血病病例均表达CD34+，而33例CD34+白血病中有13例为CD133阴性， Fauth等［9］的研究结果显示在AML中 CD133与CD34的表达密切相关，且与CD133同CD34/CD33的联合表达相比有更强的相关性。我们的结果显示CD34＋和CD34-的白血病及MDS均可表达CD133，在所有白血病及MDS病例中CD34+组的CD133阳性率高于CD34-组，且差异有统计学意义；在急性白血病患者中CD34+组的CD133阳性率也高于CD34-组，差异有统计学意义；经相关性分析显示，在所有病例组及AML和ALL病例组，CD133表达均与CD34的表达相关。CD34是一种早期造血干祖细胞最重要的抗原标记，CD133与CD34表达的相关性提示CD133可能表达于停滞在分化较早阶段的白血病细胞。
Lee等［8］发现CD133在AML原始细胞的表达与临床预后差相关。由于AML复发早、无病生存期短，因此CD133抗原可能为急性白血病预后提供分类依据。我们的研究分析表明，CD133的表达与性别、年龄、骨髓及外周血原幼细胞比例、外周血白细胞数、血红蛋白、血小板数及乳酸脱氢酶水平均无显着相关，其与生存期的关系还有待进一步的随访和研究。
国外也有报道CD133表达于CML［10］及MDS［11］，我们的研究显示CML及MDS患者骨髓细胞均有CD133的表达，但阳性率与对照组间的差别无统计学意义。值得注意的是，2例MDS转化的AML病人均为CD133高表达，是否在MDS中CD133的表达异常提示MDS有向AML的转化趋势，这还需积累
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