中药多糖及其含药血清对小鼠淋巴细胞增殖的影响.docx

中药多糖及其含药血清对小鼠淋巴细胞增殖的影响
【摘要】 　　目的探讨中药复方多糖与各单味中药多糖及其含药血清对小鼠淋巴细胞增殖的影响。方法制备各中药多糖，并分离服用各多糖后的小鼠血清，分别加入到淋巴细胞悬液中，检测小鼠淋巴细胞增殖情况。结果各多糖组和含多糖血清组均能不同程度的促进淋巴细胞增殖，其中复方多糖和含复方多糖血清组最显着。结论血清药理学方法更能真实地反映药物的药理作用；各单味中药多糖对细胞免疫具有协同促进作用。
【关键词】 中药 糖 含药血清 淋巴细胞增殖
　　Abstract：ObjectiveTo discuss the effect of polysaccharides of traditional Chinese medicine and each single herbal polysaccharide and medicated serum on lymphocyte multiplication of　polysaccharides of traditional Chinese medicines were　taking various polysaccharides,mouse serum was separated and added into lymphocyte respectively to examine lymphocyte　of the polysaccharides and medicated serum could increase lymphocyte multiplication,and the total polysaccharide of Chinese herbal recipe and its medicated serum were most　serum pharmacology can reflect pharmacological action actually;single herb polysaccharide has the coordination action to the cellular immunity.
　　Key words：Traditional Chinese medicine; Polysaccharide; Medicated serum; Lymphocyte multiplication
　　自拟中药复方免疫增强剂由党参、黄芪、当归、熟地等11味中药配伍而成，经临床应用表明该复方对雏鸡有明显增重作用，能显着提高雏鸡成活率和饲料转化率；从该复方中提取的总多糖成分对小鼠免疫功能有显着促进作用［1，2］。本实验采用血清药理学方法，培养淋巴细胞，分别加入服用复方多糖和各单味中药多糖后的小鼠血清和各多糖水溶液，进行淋巴细胞体外增殖实验，初步探讨该复方多糖和11味单味中药多糖对机体细胞免疫功能的影响，以及复方多糖与各单味中药多糖之间的关系。
　　1 材料与仪器1 动物昆明种小鼠，8～12周龄，体重18～25 ｇ，雌雄兼用，购自石河子大学动物养殖中心。2 试剂
　　MTT、RPMI-1640、标准胎牛血清均购自华美生物工程公司，台朌蓝购自北京拜尔迪生物公司。3 仪器酶标仪，二氧化碳培养箱。4 药品实验用的中药复方免疫增强剂是由党参、黄芪、当归、熟地、淫羊藿、茯苓等11味中药配伍而成，各单味中药是从石河子医药公司同次购进，按照配伍比例称取各单味药混合后制成复方。中药复方多糖和各单味中药多糖由本院中兽医实验室提供。小鼠口服剂量均指经过换算实际进入小鼠体内纯多糖的含量，各多糖用时用蒸馏水配成%的水溶液，115℃,30 min高压灭菌,备用。
　　2 方法
　　水煎剂的制备按照配伍比例称取各单味药混合后制成复方，将复方中药粉碎，充分混匀后称取复方中药 g，加100 ml水煎煮，加热同时不时搅拌，水沸后计时40 min后用纱布过滤，收集滤液，在滤渣中重新加入60 ml水煎煮，水沸后计时30 min，再用纱布过滤弃渣，合并两次滤液，浓缩至140 ml，使每毫升水煎剂中含生药50 mg。
　　含药血清的制备［3，4］小鼠随机分为14组，每组10只，实验组分别灌服复方多糖、复方水煎剂以及当归多糖、川芎多糖、淫羊藿多糖、麦冬多糖、何首乌多糖、茯苓多糖、补骨脂多糖、熟地多糖、山楂多糖、党参多糖、黄芪多糖等11味单味中药多糖，对照组灌服生理盐水，每天灌服1次，连续7 d，小鼠于末次灌胃后1 h摘除眼球取血，无菌分离血清，同组血清混合后经56℃、30 min灭活处理，再用 μm微孔滤膜过滤除菌，置-20℃保存备用。
　　实验分组药物组分为复方多糖组、复方水煎剂组和当归多糖组、川芎多糖组、淫羊藿多糖组、麦冬多糖组、何首乌多糖组、茯苓多糖组、补骨脂多糖组、熟地多糖组、山楂多糖组、党参多糖组、黄芪多糖组以及空白对照组，共14组。

　　含药血清组也分为14组，即复方多糖药物血清组、复方水煎剂药物血清组、当归多糖药物血清组、川芎多糖药物血清组、淫羊藿多糖药物血清组、麦冬多糖药物血清组、何首乌多糖药物血清组、茯苓多糖药物血清组、补骨脂多糖药物血清组、熟地多糖药物血清组、山楂多糖药物血清组、党参多糖药物血清组、黄芪多糖药物血清组和空白血清对照组。
　　淋巴细胞增殖试验［5,6］颈椎脱臼处死小鼠，无菌取出小鼠脾脏。200目滤网上捻碎，RPMI-1640液冲洗，收集含脾细胞的冲洗液，1 500 r/min离心5 min。去上清后加入预冷的%Tris-NH4Cl裂解红细胞1 min，重复裂解一次，再用1640培养液洗2～3次，弃上清，混匀。台朌蓝染色检测后，用含10%小牛血清的RPMI-1640完全培养液将脾细胞数调整为6×106个/ml的细胞悬液。于96孔平底培养板中每孔加入100 μl细胞悬液，试验组加中药多糖或含药血清，对照组加培养液，每孔做3个重复孔。37℃，5%CO2的培养箱中培养72 h，于终止培养前4 h，每孔加入10 mg/ml MTT溶液10 μl，继续培养4 h，培养结束后仔细弃去上清，每孔加酸化异丙醇100 μl，充分振荡吹打后静置20 min，用检测波长570 nm参考波长630 nm比色分析，用OD值表示结果。
　　统计学分析所有数据均用统计学软件处理，组间差异比较采用单因素方差分析。
　　3 结果
　　药物组对淋巴细胞增殖的影响
　　13个药物组与空白对照组比较，见表1。表1结果表明，13个药物组均能不同程度地增强小鼠淋巴细胞增殖反应，其中复方多糖对淋巴细胞增殖的促进作用最强，与对照组比较差异极显着；而山楂多糖组和党参多糖组对小鼠脾淋巴细胞体外增殖的促进作用相对较弱，与对照组比较差异显着，其它11个药物组对小鼠脾淋巴细胞体外增殖具有较强的促进作用，均与对照组间差异极显着。

　　根据表1结果，13个药物组对小鼠淋巴细胞的增殖的促进作用强弱顺序依次为：复方多糖复方水煎剂黄芪多糖淫羊藿多糖茯苓多糖当归多糖补骨脂多糖麦冬多糖川芎多糖熟地多糖何首乌多糖山楂多糖党参多糖。
　　复方多糖组与复方水煎剂、单味药物多糖组比较见表1。表1结果表明，与复方水煎剂组和11个单味中药多糖组比较，复方多糖组对小鼠淋巴细胞增殖的促进作用较强，优于复方水煎剂组，与之产生显着性差异()；明显优于其它11个单味中药多糖组，与这11组均产生极显着性差异()。
　　复方水煎剂组与11个单味药物多糖组比较见表1。表1结果表明，与组成复方的11个单味中药的多糖组比较，复方水煎剂组对小鼠淋巴细胞增殖的促进作用较强，优于黄芪多糖组，与黄芪多糖组产生显着性差异，显着优于其余10组，与其它10个单味中药多糖组均具有极显着性差异。
　　11个单味药物多糖组组间比较见表1。由表1可知，11个单味中药多糖组对小鼠淋巴细胞增殖促进程度不同，其中山楂多糖和党参多糖对促进小鼠脾脏淋巴细胞的增殖作用较弱，与其它9种单味中药多糖间均产生极显着性差异()；黄芪多糖与何首乌多糖间具有显着性差异()，与其它多糖无显着性差异()；当归多糖组、川芎多糖组、淫羊藿多糖组、麦冬多糖组、茯苓多糖组、补骨脂多糖组、熟地多糖组7组多糖对淋巴细胞增殖的影响程度相似，组间无差异，同时这7个多糖组与何首乌多糖组、黄芪多糖组组间也无差异()。表1 13个药物组对淋巴细胞增殖的影响
　　药物血清组对小鼠淋巴细胞增殖的影响
　　13个含药物血清组与空白血清组比较见表2。由表2结果可知，13个药物血清组中，麦冬多糖药物血清、熟地多糖药物血清、山楂多糖药物血清对小鼠淋巴细胞增殖的促进作用较弱，与对照组没有差异，其它10个药物血清组对小鼠淋巴细胞的增殖均具有不同程度的增强作用，均与对照组产生极显着性差异。

　　根据表2结果，13个药物血清组对小鼠淋巴细胞的增殖的促进作用强弱顺序依次为：复方多糖血清组复方水煎剂血清组补骨脂多糖血清组茯苓多糖血清组黄芪多糖血清组淫羊藿多糖血清组川芎多糖血清组何首乌多糖血清组当归多糖血清组党参多糖血清组麦冬多糖血清组熟地多糖血清组山楂多糖血清组。
　　表内数字右上角*或不同小写字母表示组间比较差异显着，**或不同大写字母表示组间比较差异极显着。组间有任一大写/小写字母相同，表示无极显着性/显着性差异
　　含复方多糖药物血清组与含复方水煎剂血清、11个含单味药多糖血清组比较见表2。由表2结果可知与含复方水煎剂的药物血清组和11个含单味中药多糖的药物血清组比较，含复方多糖的药物血清组能显着促进小鼠淋巴细胞增殖，显着强于其它药物血清组，与其它12个药物血清组均产生极显着性差异。表2 13个含药物血清组对淋巴细胞增殖的影响
　　表内数字右上角*或不同小写字母表示组间比较差异显着，**或不同大写字母表示组间比较差异极显着。组间有任一大写/小写字母相同，表示无极显着性/显着性差异
　　复方水煎剂药物血清组与11个单味药物多糖组比较见表2。由表2结果可知，与11个含单味中药多糖的药物血清组比较，含复方水煎剂的药物血清能显着促进小鼠淋巴细胞增殖，作用效果强于11个单味中药多糖药物血清组，与11个药物血清组均产生极显着性差异。
　　11个单味药物多糖血清组组间比较见表2。由表2可知，11个单味中药多糖血清组对小鼠淋巴细胞增殖的促进作用存在差异，含补骨脂多糖血清对淋巴细胞的增殖的促进作用最强，补骨脂多糖血清组与川芎多糖血清组、何首乌多糖血清组差异显着()；与当归多糖血清组、麦冬多糖血清组、熟地多糖血清组、山楂多糖血清组、党参多糖血清组差异极显着()；与淫羊藿多糖血清组、茯苓多糖血清组、黄芪多糖血清组间无显着性差异()。

　　另对其它10个单味中药多糖药物血清组的统计分析结果表明，当归多糖血清组与茯苓多糖血清组、山楂多糖血清组差异显着()，与补骨脂多糖血清组差异极显着()；川芎多糖血清组与茯苓多糖血清组、补骨脂多糖血清组、山楂多糖血清组差异显着()；淫羊藿多糖血清组与熟地多糖血清组差异显着( P )，与山楂多糖血清组差异极显着()；麦冬多糖血清组与茯苓多糖血清组、补骨脂多糖血清组差异极显着()；何首乌多糖血清组与茯苓多糖血清组、补骨脂多糖血清组、山楂多糖血清组差异显着()；茯苓多糖血清组与当归多糖血清组、川芎多糖血清组、何首乌多糖血清组差异显着()，与麦冬多糖血清组、熟地多糖血清组、山楂多糖血清组、党参多糖血清组差异极显着()；黄芪多糖血清组与党参多糖血清组有显着性差异()，与麦冬多糖血清组、熟地多糖血清组、山楂多糖血清组差异极显着()，但与当归多糖血清组、川芎多糖血清组、淫羊藿多糖血清组、何首乌多糖血清组、茯苓多糖血清组、补骨脂多糖血清组无显着性差异()；熟地多糖血清组与淫羊藿多糖血清组差异显着()，与茯苓多糖血清组、补骨脂多糖血清组差异极显着()；山楂多糖血清组与当归多糖血清组、川芎多糖血清组、何首乌多糖血清组差异显着()，与淫羊藿多糖血清组、茯苓多糖血清组、补骨脂多糖血清组差异极显着()；党参多糖血清组与茯苓多糖血清组、补骨脂多糖血清组差异极显着()。
　　4 讨论与小结

　　测定小鼠淋巴细胞体外增殖反应是研究小鼠细胞免疫功能的重要手段和指标。药物组实验结果表明，复方总多糖、复方水煎剂和11味单味中药多糖均具有不同程度的促进小鼠淋巴细胞增殖的作用，说明这些药物都具有促进细胞免疫功能的作用。其中山楂多糖和党参多糖的促进作用较其他药物组弱，但与对照组比较有显着性差异()。对淋巴细胞体外增殖的促进作用依次为复方多糖复方水煎剂11味单味药多糖对照。

　　中药血清药理学方法在1987年首次提出，即给予动物灌服中药或复方制剂后，在一定时间内采血，分离血清进行体外药理实验的方法。该方法克服以往中药体外实验的不利因素，比中药直接体外实验有较多的优势，能较客观和真实地阐明中药的药效和作用机制，从而有助于研究中药复方配伍规律和促进中药复方药代动力学研究的深入开展［7］。本试验采用动物含药血清代替中药煎剂和中药多糖进行体外试验，使反应体系更接近于动物体内环境，含药血清组实验结果表明，13个药物血清组中有10组能不同程度地增强淋巴细胞增殖反应，说明这些药物具有很好的免疫增强活性，能够确实增强机体的细胞免疫功能，而麦冬多糖药物血清、熟地多糖药物血清、山楂多糖药物血清对小鼠淋巴细胞增殖反应没有增强作用，这可能与有些有效成分未能从消化道吸收，或因其有效成分经消化道或肝脏代谢失活所致。同时结合以上研究者的报道，认为中药的体内实验和体外实验效果存在不一致性，只有从多方面、多层次、多角度对中药进行研究才能清楚其作用机理。

　　国内近20年来对大量中草药来源的多糖及糖缀合物，如黄芪多糖、牛膝多糖、猪苓多糖以及枸杞子糖缀合物等近百种多糖进行了化学和广泛的活性研究，相继报道了这些多糖及糖缀合物具有免疫调节、抗肿瘤、降血糖等多方面的药理作用，有的已在临床应用。已有许多研究表明，多糖是许多单味中药产生药效的活性成分。本研究结果表明，复方总多糖和含有复方总多糖的药物血清均对小鼠淋巴细胞体外增殖反应具有显着的增强作用，且其效果分别优于复方水煎剂和含复方水煎剂的药物血清，说明从复方中提取的多糖在增强小鼠细胞免疫功能方面比原复方的水煎剂效果好，本研究从中药及其化学成分对淋巴细胞增殖的影响方面，揭示了复方总多糖为该中药复方的主要活性成分之一，且各单味中药多糖之间存在协同促进作用。
【参考文献】
　　［1］罗燕,谷新利,邵永斌,等.中药复方总多糖对小白鼠免疫功能的影响［J］.中兽医医药杂志,2005,24(5):14.
　　［2］邵永斌,谷新利,罗 燕,等.中药复方总多糖及其含药血清对小白鼠免疫功能的影响［J］.中兽医医药杂志,2005,24(6):8.
　　［3］索晴,崔立然,刘树民,等.黄药子及配伍当归后含药血清抗肿瘤作用的研究［J］.中国中医药科技,2008,15(2):113.
　　［4］陈长华,方泰惠,周玲玲,等.清络通痹颗粒含药血清对体外培养的成骨细胞和破骨细胞的影响［J］.中成药,2008,30(1):35.
　　［5］徐艳,郑永唐,何 黎,等.昆明山海棠片对小鼠淋巴细胞体外增殖活化影响的研究［J］.中药材,2008,33(4):557.
　　［6］王自力,董 虹,刘凤华,等.中药有效部位组方对高温刺激小鼠肠道淋巴细胞体外增殖的影响［J］.畜牧兽医学报,2008,39(3):360.
　　［7］沈克姑,田淑琴.中药血清药理学方法及其在中兽药研究中的展望［J］.四川畜牧兽医,2007，11:34.