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二氮嗪防治低氧性肺动脉高压的作用机制
【摘要】 　　目的 探讨二氮嗪阻断低氧性肺动脉高压形成的机制，为临床治疗肺动脉高压提供理论和实验依据。方法 将SD大鼠随机分为三组：肺动脉高压组(PH)、二氮嗪阻断组(DB)和正常对照组(N)。肺动脉高压组和二氮嗪阻断组在常压低氧舱饲养20d，第10天起二氮嗪阻断组每天缺氧前半小时使用二氮嗪，按50mg/kg腹腔注射，每日1次，共10次，肺动脉高压组每天注射生理盐水3mL/kg；正常对照组：10只，常规饲养大鼠。采用组织学方法和天狼星红染色结合偏振光显微镜对照观察肺动脉高压组、二氮嗪阻断组低氧性肺动脉高压肺血管壁厚度、管腔大小以及Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白含量的变化。结果 肺动脉高压组大鼠肺血管壁厚度增加，管腔狭窄，肺间质Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白含量显着高于二氮嗪阻断组。结论 二氮嗪可以对抗由缺氧所致的肺间质纤维化和肺血管重建。
【关键词】 低氧性肺动脉高压；二氮嗪；胶原蛋白；发病机制
　　Effects of diazoxide on hypoxia pulmonary artery hypertension
　　ABSTRACT: Objective To provide the theoretical basis and experimental foundation for the clinical research and treatment of hypoxia pulmonary artery hypertension through investigating the mechanism of diazoxide on hypoxia pulmonary artery hypertension. Methods The rats were divided into three groups: the rats in the pulmonary hypertension group (PHG) and diazoxide blockage group (DBG) were kept in low oxygen cabin for 20 days. From the tenth day, the diazoxide blockage group was given intraperitoneally injection of diazoxide, 50mg/kg, once a day for 10 days. The rats in pulmonary hypertension group were injected physiological saline every day, 3mL/kg. Normal control group (NCG): the rats were raised as usual. Paraffinembedded lung sections were stained with HE and Sirius red, and lung blood vessel wall thickness and the lumen size were observed by microscopy, and collagens Ⅰ and Ⅲ were detected by polarization microscopy. Results In the pulmonary hypertension group, the lung blood vessel walls were thicker, the blood lumens were narrower than those in the diazoxide blockage group. Collogen Ⅰ and Ⅲ contents between the lung interstitium were obviously higher than those in the diazoxide blockage group. Conclusion Diazoxide may resist pulmonary interstitial fibrosis and lung blood vessel reconstruction caused by oxygen deficiency.
　　KEY WORDS: hypoxia pulmonary artery hypertension; diazoxide; collagen protein; pathogenesis
　　低氧性肺动脉高压(hypoxia pulmonary artery hypertension, HPH)是临床众多心肺疾病发生、发展的重要病理生理环节，其重要病理特点是肺血管痉挛和肺血管重构[1]，而肺血管痉挛在肺动脉高压的发病机制中的作用远没有肺血管重构重要，肺血管结构重建是持续肺动脉高压和对降压药物产生耐药的主要原因。对HPH的降压药物治疗往往只注重其扩张血管作用，而忽略了对逆转肺血管重建的研究。因此，到目前为止绝大多数的降压药物难以取得满意的远期疗效。而阻断肺动脉高压的肺血管壁重建，是治疗肺动脉高压的理想方法。所以，本文就二氮嗪在对抗缺氧所致的肺间质纤维化和肺血管重建方面的作用机制进行研究。
　　1 材料与方法
　　实验动物及其分组 选用30只近交系，封闭群SD大鼠，体重(300±20)g，随机分成三组：A组(肺动脉高压组)、B组(二氮嗪阻断组)、C组(正常对照组)，每组10只。
　　建立大鼠缺氧性肺动脉高压模型 将SD大鼠置于按薛全福等方法制作的自制常压低氧仓内。低氧开始时，先向舱内注入氮气，降低舱内氧气浓度，用测氧仪(CYESII；中国上海)监测舱内氧气浓度，使之稳定于(10±)%，低氧舱有小孔与外界相通，使舱内大气压与外界一致。舱内二氧化碳和水蒸气分别用钠石灰及氯化钙吸收。进行间断缺氧，每天8h，每周6d，第7天不缺氧，共4周。
　　分组干预 A组：缺氧性肺动脉高压组(pulmonary artery hypertension group, PHG)，10只，在常压低氧舱饲养28d，形成肺动脉高压；B组：二氮嗪阻断组(diazoxide blockage group, DBG)，10只，与A组同样的方法建立缺氧性肺动脉高压模型，但在第10天起每日缺氧前半小时使用二氮嗪，按50mg/kg腹腔注射，每日1次，共10次，缺氧性肺动脉高压组每天注射生理盐水3mL/kg；C组：正常组(normal control group, NCG)，10只，常规饲养大鼠。
　　病理学检查 动物断头处死，取肺脏，剪成5mm×5mm的小块，15%(体积分数)甲醛固定。常规石蜡包埋，切片厚度6μm，分别进行HE染色和天狼星红染色。观察各组与呼吸性细支气管伴行小动脉以及Ⅰ、Ⅲ型胶原的改变。用Motic Med 数码医学图像分析系统分析小动脉管壁最厚处厚度、管腔大小；随即选取每组每例标本5个显微镜高倍视野，分别观察胶原Ⅰ、胶原Ⅲ与整个视野的面积。
　　2 结果
　　二氮嗪对HPH大鼠肺血管形态学的影响 光镜下，正常组大鼠肺小血管很薄，管壁结构在较小血管只能隐约可见。缺氧性肺动脉高压组大鼠与呼吸性细支气管伴行的小动脉管壁出现较为明显的、不同程度的增生，管腔厚度平均为μm，管腔显着狭窄，个别血管管腔几乎消失。二氮嗪阻断组大鼠肺小动脉管壁的厚度变薄，平均厚度为μm，血管腔狭窄程度明显减轻(图1)。
　　图1 肺组织HE染色的结果
　　The results of HE staining of lung tissues (×100)
　　A: normal control group; B: hypoxia pulmonary artery hypertension group; C: diazoxide blockage group
　　二氮嗪对HPH大鼠肺间质和肺血管内胶原Ⅰ和Ⅲ的影响 天狼星红染色切片，在偏振光显微镜下，Ⅰ型胶原显示红色，Ⅲ型胶原显示为绿色。二氮嗪阻断组比缺氧性肺动脉高压组胶原Ⅰ、Ⅲ均有明显减少。在缺氧性肺动脉高压组的中小动脉血管管腔内、血管周围以及肺间质内可见分布较多的Ⅰ、Ⅲ型胶原。而在二氮嗪阻断组明显减少，血管壁很少见到有胶原分布(图2)。
　　肺组织图像分析的结果 用Motic Med 数码医学图像分析系统对HE染色和天狼星红染色切片进行了分析。结果显示：HE染色切片标本的小动脉血管管壁厚度、天狼星红染色切片标本胶原纤维的面积，在PHG组明显高于DBG组(，表1)。
　　表1 各组大鼠平均小动脉血管管壁厚度(MT)和胶原纤维面积(CFA, %)的测定结果
　　Table 1 The results of mean wall thickness and collagenous fiber area (%) in all groups
　　* vs. diazoxide blockage group; MT: wall thickness; CFA: collagenous fiber area; DBG: diazoxide blockage group; PHG: pulmonary artery hypertension group; NCG: normal control group
　　图2 肺组织天狼星红染色的结果
　　The results of Sirius red staining of lung small vessels and interstitium (×100)
　　A: normal control group; B: hypoxia pulmonary artery hypertension group; C: diazoxide blockage group
　　3 讨论

　　HPH的主要形成原因是缺氧导致的肺血管收缩和各种因素引发的肺血管重建。肺血管的重建也标志着HPH已经不可逆转。以往的研究和本实验结果都已证实：大鼠低氧性肺动脉高压由于肺小动脉收缩，导致肺动脉高压，进而右心室在高负荷下肥厚。组织学检查发现肺动脉硬化伴肺动脉主支管腔扩大和管壁中膜纤维化和内膜硬化，管壁增厚；肌性动脉内膜增生、中膜肥厚，管腔狭窄。由此可见，HPH发生的主要病理基础是肺血管的重建。那么，如何阻止或减轻肺血管的重建对于防止HPH尤为重要。

　　细胞外基质(extracellular matrix, ECM)堆积是肺血管重建的一个主要形态学特征，基质的增多主要是胶原蛋白和弹性蛋白增加，尤其是Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白的沉积增多与肺动脉高压形成和维持关系更为密切。内皮素1是维持血管壁张力的主要因子，而血管壁张力是肺动脉高压发生过程中控制胶原和弹性蛋白合成速率的最主要的生理刺激因素。因此，检测肺血管壁胶原蛋白Ⅰ、Ⅲ含量是反映肺血管重建的一个较为可靠的指标 [35]。本实验结果发现应用二氮嗪后肺血管胶原蛋白Ⅰ、Ⅲ的沉积明显减少，而且大鼠的缺氧症状明显改善。

　　ATP敏感性钾通道(KATP)不仅在低氧性肺血管收缩中起作用，而且可能在肺血管重构中也起重要作用。持续缺氧引起肺动脉高压与影响肺血管平滑肌钾通道关闭有关。钾通道的关闭也是HPH发生的重要因素之一。因此，钾通道开放剂对防治HPH具有较好的疗效。

　　由于KATP在低氧性肺血管收缩和重构中均发挥着重要作用，因此KATP被认为是研制治疗肺动脉高压药物的重要靶标。ATP敏感性钾通道开放剂(KATPCO)在治疗肺动脉高压中，具有潜在的应用价值[78]。一些研究表明[911]，KATPCO使细胞膜超极化而接近K+的平衡电位，Ca2+的内流减少，血管平滑肌舒张，缺氧组织和正常组织大鼠肺血管的收缩反应性均可被KATPCO克罗卡林和二氮嗪抑制。钟小宁等[12]研究了钾离子通道开放剂吡那地尔对低氧性肺动脉高压血管壁厚度、管腔大小及右室壁厚度变化的影响后认为，其对肺血管重建具有较好的预防和逆转作用。

　　肺血管结构重建是肺动脉压力持续增高和对扩血管药物产生抵抗的主要原因；KATPCO可降低持续缺氧及内皮素1引起的肺血管收缩，以莱马卡林(左旋克罗卡林，Cromakalin)和二氮嗪(diazoxide)作用最强。由于不仅可以扩张肺血管，而且可以直接扩张支气管平滑肌，所以在治疗肺动脉高压中，具有潜在的应用价值。本文的实验结果显示二氮嗪阻断组大鼠肺小动脉管壁的厚度变薄，血管腔狭窄程度明显减轻。二氮嗪阻断组血管管壁内以及肺间质内Ⅰ、Ⅲ型胶原比缺氧性肺动脉高压组均有明显减低。提示二氮嗪不仅可以扩张肺血管、降低肺纤维化、减缓肺血管的损伤，进而抑制肺血管的重建。这些足以说明该药可以有效的防治HPH。为临床研究和治疗肺动脉高压提供了理论依据和实验基础。但是，ATP敏感性钾通道开放剂在肺动脉高压形成过程中阻断血管重构的分子生物学机制在本实验尚未涉及，在此基础上，深入研究ATP敏感性钾离子通道开放剂对阻断肺动脉高压血管壁重构的分子生物学机制也是非常必要的。
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