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2型糖尿病中医湿热困脾证的基因表达研究

　　作者：柴可夫 黄晓玲 钱俊文 马纲
【摘要】 目的］从分子水平探讨2型糖尿病湿热困脾证的中医证候实质。［方法］抽取2型糖尿病气阴两虚证患者静脉血，检测血糖，血脂及电解质，分离血液中的白细胞，提取总RNA，化学发光方法检测基因芯片，用ScanAlyze软件采集图像，GEArray Analyzer软件分析数据。对部分差异表达基因进行RTPCR和Westernblotting方法验证。［结果］2型糖尿病湿热困脾证患者血糖，血脂，电解质与健康人有显着差异，基因芯片检测发现和健康人差异表达基因共38条，其中上调的基因有24条，下调的基因有14条并发现湿热困脾证的特异性基因。通过RTPCR和Westernblotting方法反向验证IRS2和FOXC2基因，证实2型糖尿病湿热困脾证患者和健康人白细胞中存在IRS2和FOXC2存在差异表达。［结论］应用基因芯片筛选2型糖尿病湿热困脾证的差异表达基因，为2型糖尿病辨证论治提供新思路。
【关键词】 2型糖尿病;基因芯片;辨证分型
　　糖尿病是一组由遗传和环境因素相互作用而引起的慢性疾病。因胰岛素分泌绝对或相对不足以及靶组织细胞对胰岛素敏感性降低，引起糖、蛋白质、脂肪、水和电解质等一系列代谢紊乱为主要共同标志。本研究观察糖尿病湿热困脾证的基因表达差异，探讨2型糖尿病湿热困脾证的证候实质。1 临床资料　　研究对象 对浙江中医药大学附属第二医院糖尿病防治中心400例糖尿病患者进行中医辨证分型，随机选取6例湿热困脾证患者，其中男性3例，女性3例，年龄30岁至65岁之间，年龄岁。另选取年龄与性别相匹配的健康人6例作对照，平均为岁。健康对照组皆通过血糖检查排除糖尿病，通过病史调查和体检、血象、肝肾功能、胸透、心电图等检查，排除其它内分泌疾病和各系统器质性疾病。2 现代医学诊断标准 根据1999年WHO专家咨询报告诊断标准，空腹血糖≥/L(126mg/dl)；或糖耐量试验中服糖后2小时血糖≥/L(200mg/dl)；或随机血糖≥/L(200mg/dl)。3 中医辨证标准 参照2002年版《中药新药临床研究指导原则》中“中药新药治疗糖尿病的临床研究指导原则”，湿热困脾证,主症：胸脘腹胀，或食后饱满，头身困重。次症：体形肥胖，心胸烦躁，四肢倦怠，小便黄赤，大便不爽。舌脉：舌红苔黄腻，脉滑而数。4 病例纳入和排除原则 凡符合现代医学诊断标准和中医辨证标准，可纳入试验病例。排除①有糖尿病急性并发症；②经确诊为1型糖尿病，其它类型糖尿病及妊娠糖尿病者；③年龄在40岁以下或70岁以上，妊娠或哺乳期妇女；④有严重心、肝、肾等并发症，或合并有其它严重原发性疾病，精神病患者。⑤中医辨证症状不典型，或者两型三型并见证型复杂者。
　　2 实验方法
　　一般情况 测量身高，体重。计算体重指数/身高。
　　生化检测 所有受试对象均于上午8时前空腹抽取肘静脉血10ml，用于测空腹血糖、血脂、糖化血红蛋白、胰岛素抵抗指数、血钙、血钾等生化检测。
　　基因芯片检测
　　白细胞的提取与RNA的纯化 随机选取其中3名湿热困脾证糖尿病患者和3名健康人抽取静脉血5ml，用红细胞裂解液分离白细胞，采用Trizol一步法抽提总RNA，用分光光度计在260nm和280nm分别测定吸光度，A260/A280比值在～为较纯的RNA，可用于芯片检测。
　　芯片杂交 经检测合格后的总RNA可用于合成双链DNA进行纯化。然后进行化学发光检测的Ampo LabelingLPR标记，变性的c DNA探针全部加入预热的GEAprehyb中，混匀，放在60°C待用。弃去杂交管中的GEAprehyb溶液，加入含探针的GEAhyb混合液至杂交管中，60°C下6rpm杂交。
　　化学发光检测 洗膜后加入链亲和素偶联的碱性磷酸酶，再洗膜4次，加入CDPStar化学发光底物至杂交管中，室温孵育2min。用滤纸去除多余的CDPStar溶液，用X射线胶片曝光。
　　图像采集和数据分析 运行ScanAlyze软件，将灰度TIFF格式图片的点阵转化为数字型数据，使用芯片配套软件GEArray Analyzer对原始数据进行去背景计算以及比较运算。
　　逆转录聚合酶链反应方法验证部分差异表达基因。
　　引物设计 将RNA反转录合成CDNA，用Primer5软件设计，由上海生物工程技术有限公司合成。
　　扩增引物PrimerbpIRS2FOXC2βactin上游5‘TTG AGG CGG CTA AGT CT3‘下游5‘TCC CAGgATgCTgTTgC3‘上游5‘CCT TCT ACCgCG AGA ACA AG3‘下游5‘CCGgGT CGAgCG TCC AGT AG3‘上游5‘ATG CCA TCC TGCgTC TG3‘ 下游5‘ACT CCTgCT TGC TGA TCC3‘393520566
　　扩增反应条件：

　　FOXC2 94℃5min；94℃30s；℃50s；72℃1min； 72℃5min；共30个循环

　　IRS2 94℃5min；94℃30s； ℃50s；72℃1min； 72℃5min；共30个循环

　　βactin 94℃5min；94℃30s； ℃50s；72℃1min； 72℃5min；共30个循环

　　扩增产物取10μl的βactin和10μl目的基因在%琼脂糖(含/ml)上电泳，紫外灯下观察结果并照相，吸光度扫描仪扫描后PCR条带用软件进行定量分析，结果为基因表达量对βactin内参的比值，以上结果重复3次，取平均值。
　　Westernblotting检测IRS2蛋白的表达 抽提蛋白、制备PAGE胶、膜在5%BSA溶液中室温孵育1小时以封闭膜上的非特异结合。加入HRP标记的二级抗体以结合一级抗体及HRP标记的抗生物素抗体以结合分子量标准，室温孵育膜1小时。KCTM化学发光试剂盒中两种试剂等比例混合为反应液，将膜置于反应液中室温孵育5min。去除过量的溶液，将膜夹在两塑料薄膜之间，以X光胶片曝光。图片扫描保存为电脑文件，并用ImageJ分析软件将图片上每个特异条带灰度值数字化。
　　统计学分析 各组实验数据以(x±s)表示，采用SPSS 软件处理，以One Way ANOVA方法进行方差分析，为统计学意义显着性标准。
　　3 结果
　　糖尿病湿热困脾证临床基本资料间的关系 湿热困脾证组BMI、HbAlc均高于健康对照组，其间差别有统计学意义()，湿热困脾证组ISI显着低于健康对照组()。血脂情况观察发现湿热困脾证的TG水平高于健康对照组；HDLC水平低于健康对照组；LDLC水平明显高于健康对照组，差别有统计学意义。湿热困脾证患者血清钙、血钾均低于健康对照组，见表1、表2、表3。
　　表1 糖尿病湿热困脾证与健康对照组BMI、HbAlc、ISI的比较
　　与健康组比较,*,#
　　表2 糖尿病湿热困脾证与健康对照组TG、HDLC、LDLC的比较
　　与健康组比较，*
　　表3 糖尿病湿热困脾证与健康对照组BMI、HbAlc、ISI的比较
　　与健康组比较，*
　　基因芯片检测结果
　　总RNA提取结果 总RNA紫外分光OD26/OD28在～之间，提取的总RNA28S、18S rRNA亮而浓条带清晰，RNA样品电泳条带清晰，28S比18S条带的亮度接近2∶1，质量符合分类表达谱芯片实验要求，总RNA质量完整无降解。
　　湿热困脾证糖尿病患者的基因表达研究　湿热困脾证糖尿病患者与健康对照组相比，共筛选出表达量改变比值大于2倍的基因38条，其中表达上调的基因有24条，包括受体、载体通道基因5条；分泌基因5条；信号转导基因2条；转录因子基因7条；代谢酶基因5条。表达下调的基因有14条，包括代谢酶基因2条；信号转导基因6条；受体、载体通道基因3条；转录因子基因1条；未知基因1条，见图1、表4、表5。
　　湿热困脾组健康对照组
　　图1 化学发光法Super Arrary芯片图
　　表4 糖尿病湿热困脾证与健康对照组相比表达上调基因
　　表5 糖尿病湿热困脾证与健康对照组相比表达下调基因
　　部分差异基因的验证
　　荧光定量PCR检测结果 结果显示，两条基因表达均与芯片结果相符合，其中FOXC2在湿热困脾证中表达为上调；IRS2在湿热困脾证中表达为下调，见图2、图3、表6。
　　Westernblotting检测结果 结果显示IRS2蛋白表达与基因芯片结果相一致，在湿热困脾证中表达减少，见图3。
　　Marker；1.健康对照组；2.湿热困脾组
　　图2 糖尿病湿热困脾证与健康人IRS2、FOXC2和内参照基因βactin mRNA表达湿热困脾组 2.健康对照组
　　图3 糖尿病湿热困脾证和健康对照组IRS2蛋白表达
　　表6 2型糖尿病湿热困脾证与健康人IRS2、FOXC2 mRNA及IRS2蛋白的表达
　　与糖尿病组比较，*
　　4 讨论

　　2型糖尿病属于中医“消渴”的范畴。病因为长期食用肥甘厚腻之品，而致湿热中阻，久而发为消渴。肥胖是湿热困脾型2型糖尿病的重要因素，故湿热困脾证糖尿病患者体重指数较高，肥胖往往伴随胰岛素抵抗，本项研究显示：湿热困脾证的ISI指数显着低于健康人，提示存在胰岛素抵抗。湿热困脾证糖尿病患者的血糖、血脂及电解质水平均高于健康对照组；糖尿病患者基因表达与健康人比较，差异表达基因有38条，差异基因总体呈上调趋势。这些基因与肥胖、胰岛素抵抗、早期糖尿病及糖尿病的各种并发症有关。

　　IFNγ属于分泌因子相关基因，是一种由活化T细胞产生，具有抗病毒、抑细胞生长及刺激中性粒细胞及血管内皮细胞生长的生理功能。过去已有多项研究表明：自身免疫性疾病患者的血清干扰素(INF)反应异常。淋巴细胞产生的IFNγ介导单核细胞与T淋巴细胞之间的对话。目前认为不仅1型糖尿病是一种自身免疫性疾病，而且2型糖尿病的发病也与机体的免疫功能密切相关。2型糖尿病是在遗传基础上由多因素促成的，患者有免疫异常，其胰岛细胞抗体(ICA)阳性者比ICA阴性者有更严重的β细胞损害［1］。IFNγ能显着抑制胰岛素的分泌，促进胰岛β细胞凋亡［2］。本研究中，基因芯片结果中糖尿病湿热困脾证患者的IFNγ表达上调，显着高于健康对照组，表达差异在2倍以上。L选择素属于受体、载体及其通道基因，是黏附分子选择素家族的成员之一。近年的研究显示L选择素与糖尿病血管病变的发生发展密切相关［3］，L选择素介导的活化血小板与内皮细胞、白细胞的黏附，相互作用，释放活性物质，如血小板源性生长因子、血管内皮细胞生长因子、成纤维细胞生长因子等，促进血管平滑肌增生、结缔组织生成，最终导致动脉粥样硬化的形成［4］。本研究中，糖尿病湿热困脾证患者的L选择素的表达显着高于健康对照组，可能与2型糖尿病患者伴有不同程度血管病变的并发症有关。IRS2蛋白(Mr 180 000)最初是从骨髓组织中提纯分离，称为4PS，因与IRS1有高度保守结构和一些共同功能，后定名为IRS2［5］。已证明IRS2的表达下降有助于2型糖尿病的形成。造成IRS2表达下降的原因包括基因启动子或增强子的突变，这使转录速度减小；还包括造成mRNA稳定性或转录效率下降的突变等。

　　本项研究中发现有5条特异性下调表达基因，仅存在于湿热困脾证中，而在其他证型中未见有异常表达。它们分别是：CCR2、INPPL1、AKT2、CEACAM1、NFKB1，这些基因均与2型糖尿病的发生和发展有密切的联系，本项目研究结果进一步证实它们与湿热困脾证有内在的联系。

　　通过对糖尿病湿热困脾证的基因组学研究，深化了对“湿热困脾证”本质的理性认识，将宏观现象的研究与微观机理的探讨很好的结合，中医辨证施治侧重于宏观调控，对微观的揭示还不那么精确，诊断疾病的依据往往显得较为笼统，因而影响了“治未病”的普及运用。基因表达谱是从mRNA水准反映了细胞或组织特异性表型和表达模式，与临床上出现的症状和体征有着必然的内在联系，根据基因芯片结果提供的依据不难预见糖尿病的发生发展规律，从而给出确切的基因治疗方案，这些都将在一定程度上提高糖尿病的治疗效果。
【参考文献】
1］ GonzalezAlvaro I，DominguezJimenezC，OrtizAM,et kin15 and IFNγparticipate in the crosstalk between natural killer and monocytic cells required for tumour necrosis factor production［J］.ArthritisResTher，2006，8(4): R88.
　　［2］ Aiello　factor induced retinal permeability is mediated by an orally effective βisoformsdection inhibitor［J］.Diabetes,1997,40:1473.
　　［3］ HafeziMoghada A,Thomas KL,Prorock A,et selectin shedding regulates leukocyte recruitment［J］.JexpMed,2001,193(7):863872.
　　［4］ LIU LH,LI J,ZHANG　between levels of circulation ICAM1,VCAM1，Lselectin and cardiovascular diseases with OSAS［J］.Zhongguo Xiandai Yixue,2002,12(7):4.
　　［5］ KIRSTEN F，HOWLETT，KEI Sakamoto，et　signaling after exercise in insulin receptor substrate2deficient mice［J］.Diabetes,2002,51(2):479483.