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何首乌苯甲酮合成酶基因的克隆及序列分析
【摘要】　目的克隆何首乌苯甲酮合成酶基因并作序列分析。方法以何首乌Polygonum multiflorum Thunb.为材料，根据其它植物苯甲酮合成酶(Benzalacetone synthase，BAS)基因cDNA序列的保守区域设计引物，利用RTPCR和3`RACE，克隆其基因。结果从何首乌叶cDNA中克隆出了长度为1 049 bp的基因片段。序列分析表明该片段具有典型的CHS基因家族的结构域，为何首乌的BAS基因片段，命名为PmBAS。将得到的序列提交GenBank，序列号为FJ601686。对获得的PmBAS的氨基酸序列进行比较分析，发现PmBAS不含有Phe215，这种差异可能是CHS与BAS催化不同反应的重要原因之一。何首乌BAS与其它植物CHS的氨基酸序列的进化分析表明，其与同为蓼科的虎杖和掌叶大黄的同源性较近。结论对利用基因工程技术促进何首乌蒽醌合成具有重要意义。
【关键词】　何首乌； 苯甲酮合成酶； 基因克隆； 序列比较
蒽醌是一类重要的中草药活性成分，常见于何首乌、决明、大黄、虎杖、芦荟和茜草等植物中，具有抗菌、泻下、利尿、抗氧化和过氧化作用、抗诱变和保肝等多种功效［1， 2］。Dewick等［3］与VELIEK等［4］认为，蒽醌的合成大致分为3个阶段：①以乙酰辅酶A为起始单元，连续与8个丙二酸单酰辅酶A发生缩合，引入8个二碳单位，最后生成蒽醌的基本骨架——八酮化合物；②八酮化合物经过还原、脱羧及氧化等步骤，形成大黄酚、芦荟大黄素与大黄酸等蒽醌类化合物；③八酮化合物经过水解、脱羧、脱水与甲基化等步骤，形成大黄素与大黄素甲醚等蒽醌类化合物。在第1阶段中，催化乙酰辅酶A与丙二酸单酰辅酶A缩合的反应是由植物查尔酮合成酶系催化完成的。查尔酮合成酶系属于植物Ⅲ型聚酮合成酶的一个家族，包括了查尔酮合成酶、芪合成酶、 吡喃酮合成酶、苯甲酮合成酶、吖啶酮合成酶 和芦荟松合成酶等成员，它们的氨基酸序列相似性达60%～70%［5， 6］。近几年来，一系列功能不同的查尔酮合成酶系不断从蓼科植物中被克隆和鉴定。如Abe等［5］从蓼科植物掌叶大黄Rheum palmatum Linn.中克隆得到CHS与BAS。CHS能催化3分子的丙二酸单酰辅酶A和1分子对香豆酰辅酶A结合形成查尔酮。BAS能催化1分子pcoumaroyl辅酶A与1分子的丙二酸单酰辅酶A，缩合生成具有抗炎作用的苯乙烯基丙酮。Junghanns等［7］也从掌叶大黄中克隆得到ALS，能够催化6分子的乙酰辅酶A，形成芦荟松。Samappito［8］等也从园叶大黄Rheum tataricum中克隆得到STS。
　　何首乌Polygonum multiflorum Thunb.，蓼科传统中药，具有补肝肾、益精血、乌须发、生发、强筋骨之功效，主要含蒽醌、二苯乙烯苷类化合物和卵磷脂等活性成分［1， 2］。我们以何首乌为材料，采用RTPCR技术克隆其BAS基因，并进行序列分析。这对从分子水平上探讨蒽醌的生物合成机制中具有重要的指导意义，并为下一步利用转基因技术来提高何首乌蒽醌产量的研究奠定基础。
　　1 材料与试剂
植物材料 何首乌Polygonum multiflorum Thunb.采自西南　大学峨眉校区。
　　Taq酶、限制性内切酶、分子量Marker为Takara产品；DNA电泳凝胶回收试剂盒购自OMEGA公司；其余试剂均为上海生工生物工程公司产品。
　　2 方法
　　总RNA的提取剪取何首乌幼嫩的叶片，加液氮研磨成粉末，RNA的提取使用Tiangen公司的RNAplant 植物总RNA提取试剂，具体步骤按说明书进行。
　　cDNA的获得以纯化的RNA为，以oligo(dT)18: 5`GCTGTCAACGATACGCTACGTAACGGCATGACAGTG(T)183`为反转录引物，采用AMV反转录酶进行反转录获得cDNA。
　　引物设计与合成根据Genbank所报道的已知植物的BAS基因的cDNA序列，使用Primer Premier 引物设计，由上海英俊生物技术服务有限公司合成所有引物，序列中间片段引物，正向引物(P1)：5′GAATGGGGCCAACCC(T)AAGTC3′；反向引物P2)：5′CCATAG(C)TCGTTCAACACTTG3′。3`RACE引物，3P1：5′TGT CCA AGA CTC TTC CCG TAC3′；3P2：5′TATCCTGGA CCATGTTGAAGC3′。
　　PCRPCR扩增采用BioRAD公司的MG96G梯度PCR仪，反应条件按引物的碱基组成进行设置。
　　克隆与测序PCR产物在1%琼脂糖凝胶上电泳后，利用OMEGA公司的胶回收试剂盒回收产物，连接到pMD18T载体，构建重组质粒。转化大肠杆菌感受态细胞，筛选重组子并用菌落PCR检测，送由上海英俊生物技术服务有限公司测序。
　　核苷酸序列分析采用InterProScan 进行结构域和功能位点预测。利用NCBI (www. ncbi. nih. gov)的BLAST 在线分析工具分别对GenBank数据库进行序列比对分析。采用DNAman软件进行序列的多重比较及与进化树绘制。
　　　3 结果
　　电泳结果何首乌的BAS的中间片段PCR和3`RACE的扩增结果如2所示，中间片段引物进行PCR扩增后得到约660 bp的片段，3`RACE扩增出约600 bp的片段。
　　PCR产物的测序分别将PCR产物进行测序。BAS基因克隆的中间片段和3`片段分别测得为659 bp和595 bp。根据两个片段的测序结果，利用Vector NTI Suite 7拼接得到何首乌的BAS基因的部分序列，命名为PmBAS。而PmBAS基因长度为1049 bp，其最长的ORF编码一个由276个氨基酸残基组成的蛋白。InterProScan在线分析结构域和功能位点表明，PmBAS具有查尔酮合成酶基因家族的N末端和C末端序列特征(图4)，说明所获得的基因序列属于查尔酮合成酶基因家族，GenBank登录号为FJ601686。
　　不同植物CHS与BAS基因的序列比较与进化分析 以PmBAS序列进行Blast在线序列比对，结果表明该基因的核苷酸序列与其它植物CHS家族的相似性较高，均超过74%以上。PmBAS基因的核苷酸序列与虎杖(Polygonum cuspidatum)、大黄(Rheum palmatum)、杨树(Populus trichocarpa)、白杨(Populus alba)等植物CHS家族的核苷酸一致性分别为94 %，86 %，76 %和76 %。利用DNAMAN软件将获得的PmBAS基因推导的氨基酸序列与其它几种植物CHS基因家族的氨基酸序列进行多重比对，并构建进化树。可以看出，查尔酮合成酶系被分为查尔酮合成酶与非查尔酮合成酶两个亚家族［5］，其中BAS、ALS、2PS与ACS构成非查尔酮合成酶亚家族，而绝大部分CHS［除圆叶牵牛CHS］与STS构成了查尔酮合成酶亚家族。何首乌与蓼科的虎杖(Polygonum cuspidatum)的同缘关系最近，与蓼科的掌叶大黄( Rheum palmatum)的同缘关系也较近，而与其它植物的同缘关系较远。
　　PmCHS与PmBAS基因的氨基酸序列比较查尔酮合成酶系具有高度保守的催化活性中心，通过调控活性中心腔内的空间大小决定了起始底物的选择性和聚酮链的长度。Phe215位于活性位点口袋的入口处，调控一系列缩合反应中适合的底物和中间产物的进入，同时有利于丙二酸单酰CoA的脱羧。PmBAS保留了催化聚酮合成的三个必需氨基酸残基，推测PmBAS也能够催化聚酮的合成。然而在PmBAS分子中，Phe215被Leu215替代，阻碍了丙二酸单酰辅酶A进入活性中心腔，导致PmBAS不能够连续缩合丙二酸单酰辅酶A，而只能催化1分子的丙二酸单酰辅酶A参与反应。
　　3 讨论
通过克隆与活性成分形成关系最密切的生物合成相关基因入手，阐明中药活性成分的生物合成及其调控机制，是植物基因工程的一个重要领域。本研究采用RACE技术克隆PmBAS的基因，这对进一步研究其功能、表达特征以及利用基因工程技术促进何首乌蒽醌合成具有重要意义。由于何首乌叶片中含较多的次生代谢物，造成RNA的提取困难，目前我们正在进一步改进RNA提取方法，同时PmBAS的5`RACE实验也正在进行中。
【 参考　文献 】
　　1］Yi T， Leung K S， Lu G H， et al. Identification and determination of the major constituents in traditional Chinese medicinal plant Polygonum multiflorum Thunb by HPLC coupled with PAD and ESI/MS ［J］. Phytochemistry Analysis， 2007， 18(3): 181.
　　［2］Choi S G， Kim J， Sung N D， et al. Anthraquinones， Cdc25B phosphatase inhibitors， isolated from the roots of Polygonum multiflorum Thunb ［J］. Natural Product Research， 2007， 21(6):487.
　　［3］Dewick PM. Medicinal Natural Products ［M］. New York: Academic press， 2002: 193.
　　［4］VELISEK J， DAVíDEK J， CEJPEK K. Biosynthesis of food constituents: Natural pigments ［J］. Czech Journal Food Science， 2007， 25(6): 291.
　　［5］Abe I， Takahashi Y， Morita H， et al. Benzalacetone synthase: A novel polyketide synthase that plays a crucial role in the biosynthesis of phenylbutanones in Rheum palmatum ［J］. Journal of European Biochemistry， 2001， 268: 3354.
　　［6］张萍，陈国神.植物Ⅲ型聚酮合酶的研究进展［J］. 中草药，2008，39：309.
　　［7］Junghanns K T， Kneusel R E， Baumert A， et al. Molecular cloning and heterologous expression of acridone synthase from elicited Ruta graveolens L. cell suspension cultures ［J］. Plant Molecular Biology， 1995， 4: 681.
　　［8］Samappito S， Page JE， Schmidt J， et al. Aromatic and pyrone polyketides synthesized by a stilbene synthase from Rheum tataricum ［J］. Phytochemistry， 2003， 62 (3): 313.