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C基因型HBV转基因小鼠的制备

　　作者：尤玉琴，黄黎珍，刘光泽，佟明华，李秀梅，胡莲美，顾为望，孔祥平
【摘要】 　　目的： 建立C型HBV转基因小鼠，为乙肝防治研究提供实验动物模型. 方法： 采用受精卵显微注射法，制备HBV转基因小鼠，用PCR，ELISA,荧光定量PCR和免疫组化的方法研究HBV基因在转基因小鼠体内的整合、复制和表达情况. 结果： 注射受精卵2840枚，筛选注射后成活的受精卵共2256枚，注射成活率％. 注射后受精卵共移植假孕雌鼠85只，其中有42只怀孕，假孕雌鼠妊娠率49％，共产下F0代小鼠168只，PCR检测共有14只小鼠阳性，其中ELISA检测血清HBsAg阳性5只,HBeAg均阴性. 荧光定量PCR血清HBV DNA显示，2只小鼠的拷贝数分别为×105copies/L,×105copies/L，经传代产下F1代小鼠61只，PCR检测HBV DNA阳性5只，ELISA检测HBsAg阳性4只，其中肝脏HBsAg免疫组化阳性2只，HBcAg均阴性，且肝组织表达HBsAg为胞浆型. 结论： 构建的C型HBV基因不但可以在转基因小鼠体内进行复制表达，而且可以遗传给下一代小鼠.
【关键词】 肝炎病毒 乙型 小鼠转基因 肝炎表面抗原 乙型 肝炎核心抗原 乙型 血清 DNA
　　【Abstract】 AIM： To generate HBV (C) genome transgenic mice to provide suitable animal models for the related researches in China. METHODS： The HBV transgenic mice were generated by microinjection of　copies HBV genome into the pronucleus of FVB/N zygotes. The PCR assay,ELISA,RT-PCR and immunohistochemical methods were used to detect the HBV integration,replication and expression in the transgenic mice. RESULTS： In this study,2840 zygotes were injected,the survived 2256 zygotes after microinjection were reimplanted into the oviducts of 85 psudopregnant KM female mice. After birth,42 female mice were pregnant and 168 F0 offsprings were born. PCR analysis indicated that 14 out of 168 F0 were integrated with HBV genome. With ELISA,5 of them expressed HBsAg in serum. And two mice were positive for HBV DNA replication in serum with ×105copies/L and ×105 copies/L respectively. Then the transgenic mice were mated to normal mice to establish transgenic mouse strain. 61 F1 offsprings were born. Further study demonstrated that 5 of them were integrated with HBV genome by PCR,4 of them were serum HBsAg positive by ELISA and 2 of them with the intracellular distribution of HBsAg in hepatocytes by immunohistochemistry. Both serum HBeAg and liver HBcAg immunohistochemistry were negative. CONCLUSION： The established HBV (C) genome could be not only replicated and expressed in transgenic mice but also inherited to the next generations.
　　【Keywords】 hepatitis B virus mice transgenic,hepatitis B surface antigens;hepatitis Bcore antigens；serum;DNA
　　0 引言

　　根据HBV基因序列的差异＞8%，可将HBV毒株分为不同的基因型，目前已确定有A-H 8个基因型. 不同基因型呈一定的地理区域性分布，并且HBV基因型与其流行特征、致病性、疾病治疗及预后等方面存在十分紧密的关系［1-5］. 我国HBV的主要流行株有B型和C型，而C型在全国各地均有流行，尤其以北方地区流行为主，有的城市甚至高达69％［6］. 转基因小鼠的建立，为乙型肝炎的基础研究和抗HBV药物的研究提供良好动物模型. 因此我们在成功建立培育D型HBV转基因小鼠基础上［8］，又在国内率先构建C型倍加长片段，并利用显微注射法试图建立一种C型HBV基因高效复制和表达的转基因小鼠，以期为乙型肝炎预防和治疗研究提供更加理想的动物模型.
　　1 材料和方法
　　材料 SPF级KM雌性小鼠体质量20～22 g，6～8 wk龄；雄性小鼠22～25 g，8～10 wk龄，由南方医科大学实验动物中心提供(合格证号： 2006A044)，雄性鼠结扎后用于制备假孕母鼠，雌性鼠则用作胚胎移植的受体鼠. SPF级FVB小鼠，4～5 wk龄，由解放军第458医院全军肝病中心转基因室提供，做为供卵鼠. 质粒pUC19-HBV(C)由解放军第458医院佟明华博士构建. 仔鼠鉴定用引物P1： 5′-TTCTTTCCCGATCACCAGTT-3′，P2： 5′-TAACACGAGCAGGG GTCCA-3′ 由Invitrogen 公司合成. Taq酶及PCR相关试剂购自Takara公司. HBsAg ELISA 检测试剂盒购自上海科华公司；HBV PCR 荧光定量检测试剂盒为深圳匹基生物公司生产，荧光PCR仪为美国检测试剂盒购自福州迈新生物技术公司，免疫组化检测抗体购自Dako公司.
　　方法
　　注射用(C) DNA片段的准备 质粒pHBV(C) 是将 拷贝 C型HBV 基因组DNA克隆于PUC-19的Sma I位点，用限制性内切酶酶切质粒pHBV(C)，10 g/L琼脂糖凝胶电泳回收大小约为的条带，即为目的转基因片段HBV(C)，纯化后溶于TE备用.
　　显微注射法制备 C型 HBV转基因小鼠 选4～5 wk龄发育良好的FVB/N母鼠，孕马血清5 U，ip，48 h后注射人绒毛膜促性腺激素5 U，激素超排处理后与FVB/N公鼠1∶1合笼，次日清晨检阴栓阳性为显微注射用受精卵供体鼠. 将结扎KM公鼠与正常KM母鼠合笼，选取有阴栓且阴门肿胀、红润的母鼠做为注射后受精卵移植的受体鼠. 将HBV(C)溶液利用原核显微注射的方法直接注入超排得到的FVB/N单细胞受精卵的原核内，取注射存活的受精卵移植到假孕KM母鼠的输卵管内. 待其怀孕产仔后，进行检测.
　　转基因小鼠HBV基因整合及复制表达检测取小鼠尾组织基因组DNA进行PCR检测，反应体系50 μL按94℃，30 s；55℃，30 s；72℃，45 s 共35 个循环. 取产物10 μL进行琼脂糖电泳，做PCR分析. 对PCR阳性鼠，在眼眶后静脉丛采血300 μL，37℃放置2 h，3000 r/min离心6 min，取上清. ELISA检测HBsAg/HBeAg，定量检测HBV DNA，使用实时荧光PCR仪进行结果分析. 取小鼠肝脏，置40 g/L中性甲醛中，4℃固定12～14 h. 按常规方法制作组织切片，进行免疫组化分析. HBsAg抗体1∶500稀释，HBcAg抗体1∶500稀释.
　　2 结果
　　目的基因的整合 共注射受精卵2840枚，筛选注射后成活的受精卵共2256枚，注射成活率％. 注射后受精卵共移植假孕雌鼠85只，其中有42只怀孕，假孕雌鼠妊娠率49％，共产下F0代小鼠168只，PCR检测共有14只整合阳性，携带有外源目的基因，PCR产物电泳后在500 bp处有一条带，为阳性小鼠(图1).
　　1: 阳性对照; 2: 阴性对照.
　　图1 F0代转基因小鼠基因组DNA PCR 检测结果
　　目的基因的体内复制和表达 对PCR检测HBV DNA阳性小鼠血清进行HBsAg ELISA 检测，HBsAg阳性鼠有：A56，A69，A74，A81，A82，其中A56和A69呈较弱阳性. HBeAg检测均为阴性. 同时，PCR检测HBV DNA阳性小鼠血清HBV DNA荧光定量PCR显示，2只小鼠的拷贝数大于105copies/L，分别为A55号鼠(×105copies/L)和A69号鼠(×105copies/L).
　　转基因小鼠的传代及检测 将ELISA阳性鼠与正常的FVB/N小鼠合笼，经传代产下F1代小鼠61只，PCR检测阳性5只，ELISA 检测HBsAg阳性4只，其中肝脏HBsAg免疫组化阳性有2只，且呈胞浆型表达. 而HBcAg免疫组化均为阴性，肝细胞无表达.
　　1：阳性对照；2：阴性对照;M: marker.
　　图2 F1代转基因小鼠基因组DNA PCR 检测结果
　　3 讨论

　　近年来国内外许多研究均表明［7-8］，HBV基因型与基因变异、感染后疾病临床表现、抗病毒治疗及预后等方面都有密切的关系. 与以往传统的血清型分型方法比较，HBV基因分型更具临床意义. 血清型是由病毒外膜蛋白上的一些氨基酸残基决定的，是病毒外膜蛋白的表现型，并不能真正反应病毒基因组的差异，而且人们发现它的临床意义并不是很大. 因此，确定HBV基因型对乙肝基础研究和感染风险预测及临床治疗方案选择具有一定的意义. 目前，国内外有关复制型HBV转基因小鼠的研究较多［8］，但大多数是D型等欧洲流行株转基因小鼠，而针对我国C型流行株的研究甚少. 随着HBV基因型临床意义的不断研究验证，C型转基因小鼠的研究对我国乙肝研究具有更重要的意义.
　　A:B12; B:B26.
　　图3 F1代ABV转基因小鼠肝脏HBsAg的表达
　　显微注射法制备转基因动物是一项技术性很强的工作，操作精细，涉及的步骤繁杂，其效率的高低受多方面因素影响. 首先要获得高质量的受精卵，即细胞饱满、边缘光滑、透明带界面清晰，雌雄原核清晰可见. 我们也采用FVB/N近交系小鼠为供体鼠，发现其受精卵原核比国内常用的KM鼠大且清晰，比KM鼠更易于注射. 但超排卵的异常率不稳定，有时只有15％，有时高达80％，可能与小鼠个体差异环境因素有关. 注射后胚胎移植是影响整个实验的最后关键因素，影响胚胎移植成功的因素很多,主要包括受体的选择和胚胎移植操作技术. 我们采用传统的撕破囊膜移植方法，赵四海等［9］应用改进后的囊膜穿刺胚胎移植，与传统的方法与进行比较发现，囊膜穿刺胚胎移植方法避免撕破囊膜，降低术中出血和术后炎症引起的输卵管手术部位和腹壁的粘连，但是该方法的移植技术要求更高，且费时较长. 本实验移植后受体的怀孕率达％，高于多数报道 ［10］，说明本实验胚胎移植操作方法可行且操作技术较好. 本实验中，F0代小鼠PCR阳性有14只，其中有5只小鼠血清ELISA阳性，2只小鼠血清HBV DNA 有复制. 经传代产F1代61只，其中PCR阳性仅有5只，可能由于部分小鼠传代丢失所致. 而F1代小鼠ELISA阳性4只，其中2只肝脏免疫组化阳性，表明在该基因可传至下一代. 但上述获得HBV转基因小鼠其复制表达水平较低，尚未达到与本课题组早期制备D型HBV转基因小鼠相近水平，我们正从多方面研究提高.
【参考文献】
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　　［6］ 刘 兴，唐 红，何 芳. 乙肝病毒基因型研究新进展［J］. 世界华人消化杂志，2006，14：2211-2216.
　　［7］ Lim CK,Tan JT,Khoo JB,et al. Correlations of HBV genotypes,mutations affecting HBeAg expression and HBeAg/anti-HBe status in HBV carriers［J］. Int J Med Sci,2006,3:14-20.
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　　［10］ 吴金明，林菊生，陈碧涛，等．乙型肝炎病毒基因组转基因小鼠模型的制备和鉴定［J］. 中华肝脏病杂志，2006，11：338-340.