大肠菌群计数作业指导书.doc

大肠菌群计数（MPN计数法）作业指导书
1.0 目的
规定大肠菌群计数的方法。
2.0 适用范围
适用于产品中的大肠杆菌群的计数。
3.0 术语
3.1 大肠菌群：在一定培养条件下能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌。
3.2 MPN最可能数：基于泊松分布的一种间接计数方法。
4.0 检验原理
MPN 法是统计学和微生物学结合的一种定量检测法。待测样品经系列稀释并培养后,根据其未生长的最低稀释度与生长的最高稀释度,应用统计学概率论推算出待测样品中大肠菌群的最大可能数。
5.0 作业流程图
见附录A。
6.0 内容及要求
6.1 设备和材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其它设备和材料如下：
6.1.1 恒温培养箱：36℃±1℃
6.1.2 恒温水浴箱：46℃±1℃
6.1.3 天平：感量0.1g
6.1.4 均质器
6.1.5 无菌吸管：1ml（具0.01刻度）、10ml（具0.1刻度）或微量移液器及吸头。
6.1.6 无菌锥形瓶：容量500ml
6.1.7 无菌试管：16mm×160mm、18mm×180mm
6.1.8 无菌玻璃珠：直径约5mm
6.1.9 无菌倒管
6.1.10 精密PH试纸
6.2 培养基和试剂
6.2.1 月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤(LST)
6.2.2 煌绿乳糖胆盐肉汤(BGLB)
6.2.3 1mol/LNaOH 溶液:称取40g氢氧化钠溶于1000mL无菌蒸馏水中。
6.2.4 1mol/L HCl溶液：移取浓盐酸90mL,用无菌蒸馏水稀释至1000mL。
6.2.5 75%乙醇溶液
6.2.6 无菌生理盐水：称取8.5g氯化钠溶于1000ml蒸馏水中，121℃高压灭菌15min。
6.3 操作步骤
6.3.1样品稀释
a、 固体和半固体样品：称取25g样品置于盛有225ml无菌生理盐水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1-2min，制成1：10的样品匀液。
b、 液体样品：以无菌吸管吸取25ml样品置于盛有225ml的无菌生理盐水的无菌锥形瓶(瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠)中，充分混匀，制成1：10的样品匀液。
c、 样品匀液的pH 应在6.5-7.5之间,必要时分别用1mol/LNaOH 或1mol/L HCl调节。
d、 用1ml无菌吸管或微量移液器吸取1：10样品匀液1ml，沿管壁缓慢注入盛有9ml无菌生理盐水的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用1支1mL 无菌吸管反复吹打,使其混合均匀,制成1∶100的样品匀液。
e、 根据对样品污染状况的分析，按上述操作，依次制成10倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释一次，换用一支1ml无菌吸管。从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过15min。

6.3.2初发酵试验
a、 每个样品，选择3个适宜的连续稀释度的样品匀液（液体样品可以选择原液），每个稀释度接种3管月桂基硫酸胰蛋白胨（LST）肉汤，每管接种1ml。
b、 将以上接种好的试管置于36±1℃培养24±2h，观察倒管内是否有气泡产生，24h±2h产气者进行复发酵试验(证实试验),如未产气则继续培养至48h±2h,产气者进行复发酵试验。未产气者为大肠菌群阴性。
6.3.3复发酵试验(证实试验)
用接种环从产气的 LST 肉汤管中分别取培养物1 环,移种于煌绿乳糖胆盐肉汤(BGLB)管中,36 ℃±1 ℃培养48h±2h,观察产气情况。产气者,计为大肠菌群阳性管。
6.34大肠菌群最可能数（MPN）的报告
按6.3.3确证的大肠菌群 BGLB阳性管数,检索 MPN 表(见附录 B),报告每g(mL)样品中大肠菌群的 MPN 值。

附录A
大肠菌群MPN计数检验程序
检样
25g（ml）样品+225ml稀释液，均质
10倍系列稀释
选择适宜三个连续稀释度的样品匀液，接种LST肉汤管
36℃±1℃ 48h±2h
不产气
产气
BGLB肉汤
36℃±1℃ 48h±2h

不产气
产气
大肠菌群阴性
大肠菌群阳性
查ＭＰＮ表
报告结果

附录B
大肠菌群最可能数MPN）检索表
每克（或每毫升）检样中大肠菌群最可能数（MPN）的检索见下表：
阳性管数
MPN
95%可信限
阳性管数
MPN
95%可信限
0.1
0.01
0.001
下限
上限
0.1
0.01
0.001
下限
上限
0
0
0
<3.0
—
9.5
2
2
0
21
4.5
42
0
0
1
3.0
0.15
9.6
2
2
1
28
8.7
94
0
1
0
3.0
0.15
11
2
2
2
35
8.7
94
0
1
1
6.1
1.2
18
2
3
0
29
8.7
94
0
2
0
6.2
1.2
18
2
3
1
36
8.7
94
0
3
0
9.4
3.6
38
3
0
0
23
4.6
94
1
0
0
3.6
0.17
18
3
0
1
38
8.7
110
1
0
1
7.2
1.3
18
3
0
2
64
17
180
1
0
2
11
3.6
38
3
1
0
？
9
180
1
1
0
7.4
1.3
20
3
1
1
75
17
200
1
1
1
11
3.6
38
3
1
2
120
37
420
1
2
0
11
3.6
42
3
1
3
160
40
420
1
2
1
15
4.5
42
3
2
0
93
18
420
1
3
0
16
4.5
42
3
2
1
150
37
420
2
0
0
9.2
1.4
38
3
2
2
210
40
430
2
0
1
14
3.6
42
3
2
3
290
90
1000
2
0
2
20
4.5
42
3
3
0
240
42
1000
2
1
0
15
3.7
42
3
3
1
460
90
2000
2
1
1
20
4.5
42
3
3
2
1100
180
4100
2
1
2
27
8.7
94
3
3
3
>1100
420
—
注1：本表采用3个稀释度［0.1g（或0.1ml）、0.01g（或0.01ml）和0.001g（或0.001ml）］，每个稀释度接种3管。
注2：表内所列检样量如改用1g（或1ml）、0.1g（或0.1ml）和0.01g（或0.01ml）时，表内数字应相应降低10倍，如改用0.01g（或0.01ml）、0.001g（或0.001ml）、0.0001g（或0.0001ml）时，则表内数字应相应增高10倍，其余类推。

参照：GB4789.3—2016