大肠菌群检测过程中可能遇到的常见问题及解答.docx

大肠菌群检测过程中可能遇到的常见问题及解答
一、 常用检测标准
GB/T 4789.3-2003 食品卫生微生物学检验 大肠菌群测定
GB 4789.3-2016 食品安全国家标准 食品微生物学检验 大肠菌群计数
GB 4789.28-2013 食品安全国家标准 食品微生物学检验 培养基和试剂的质量要求
GB 4789.1-2016 食品安全国家标准 食品微生物学检验 总则
GB 4789.41-2016 食品安全国家标准 食品微生物学检验 肠杆科检验
GB/T 27405-2008 实验室质量控制规范 食品微生物检测
GB/T 16294-2010 医药工业洁净室（区） 沉降菌的测试方法

二、 常见问题及解答
（一）检测方法选择
Q1：食品中大肠菌群的检测有两个标准三种方法，该如何选择呢？
A：依据产品标准的项目单位
1、若单位为CFU/g，则选择GB 4789.3-2016第二法（平板计数法）。如：GB 19300-2014 食品安全国家标准 坚果与籽类食品；
2、若单位为MPN/g，则选择GB 4789.3-2016第一法（MPN计数法）。如：NY/T 1885-2017 绿色食品 米酒；
3、若单位为MPN/100g，则选择GB/T 4789.3-2003。如：Q/KSJ0001S-2018 果蔬脆片。
Q2：MPN法3个适宜的连续稀释度该怎样选择？
A：依据产品标准的项目标准值
1、若标准值为＜3.0MPN/g，则选择0.1g、0.01g、0.001g三个稀释度。如：NY/T 1885-2017 绿色食品 米酒；
2、若标准值为≤30MPN/100g，则选择1g、0.1g、0.01g三个稀释度。如：Q/KSJ0001S-2018 果蔬脆片。1g由接种10mL 0.1g/m L至双料乳糖胆盐发酵管得来。

（二）样品采样方法
Q3：怎样采样，才能使样品具有代表性？
A：这里将样品分为两类：预包装食品和散装食品或现场制作食品。
1、对于预包装食品
A、应采集相同批次、独立包装、适量件数的食品样品，每件样品的采样量应满足微生物项目检验的要求。
B、独立包装≤1000g 的固态食品或≤1000mL 的液态食品，取相同批次的包装。
C、独立包装＞1000mL 的液态食品，应在采样前摇动或用无菌棒搅拌液体，使其达到均质后采集适量样品，放入同一个无菌采样容器内作为一件食品样品；＞1000g 的固态食品，应用无菌采样器从同一包装的不同部位分别采取适量样品，放入同一个无菌采样容器内作为一件食品样品。
2、对于散装食品或现场制作食品
用无菌采样工具从 n 个不同部位现场采集样品，放入 n 个无菌采样容器内作为 n 件食品样品。每件样品的采样量应满足微生物项目检验单位的要求。

（三） 物资准备
Q4：结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）使用前不需要高压灭菌，是否会存在污染的可能？
A：大肠菌群是不能形成芽孢的，在VRBA培养基煮沸的过程中，即使有大肠菌群存在也会被杀灭，所以不会从培养基带入污染。当然盛装培养基的容器需要进行高压灭菌，以免容器引入污染。此外，VRBA是一种选择性培养基，含有的结晶紫对革兰氏阳性菌有比较强的抑制作用而对革兰氏阴性菌几乎没有作用，且平板培养产生的菌落还需要进行复发酵验证，因此VRBA培养基就无需高压灭菌。但需要注意的是，VRBA需要现配现用，完成配制的培养基应当在3h之内使用完毕。
Q5：MPN管灭菌后为什么小导管内会有气泡以及该如何解决？
A：原因一：过早打开灭菌锅
当灭菌锅压力表降为0而温度表示数还高于室温时，不要打开灭菌锅。因为打开锅盖瞬间，锅内大量热量散出，温度突然降低，试管内温度也随着降低，导致管内气压减小，沸点降低，部分水会汽化留在小导管内。
解决措施：待灭菌锅内气压和温度都降到与室温一致或相差不大时再打开灭菌锅。
原因二：试管塞塞得太紧（使用硅胶塞的时候）
试管塞塞得太紧在灭菌时会导致试管内与灭菌锅内压力不一致。在灭菌锅升温升压时，锅内压力会大于管内压力。锅内压力会大于管内压力时，试管内压力不够，不能将小导管内气体排尽，就留有气泡；试管塞塞得太紧同样会导致灭菌锅降温降压时，锅内压力小于管内压力。锅内压力小于管内压力时，可能会使试管塞和培养基崩出，培养基报废。
      解决措施：改用透气性好的棉花塞，切勿使用橡皮塞。
原因三：小导管口径太小
      我们把一根毛细管一端封口，另一端插进水里，毛细管里怎么都不会进水。同样把一个烧杯倒扣进水里就很容易进水了。小导管在加压后一方面水要进去，另外里面的空气要出来，如果口太小的话，空气不容易出去，水也不容易进来，就会导致气泡留在里面。
      解决措施：改用内径较大的导管，尽量使用V型管，不要使用锥型管。
原因四：培养基质量问题
      由培养基质量引起的气体不能排尽或培养基含有高温高压分解产气的成分。灭菌时用水做培养基组的对照试验，若培养基组有气泡，而对照组没有气泡，可确定是有此原因引起。
解决措施：改用其它品牌的培养基，且培养基使用前要通过技术验收。
原因五：灭菌锅工作压力不够，使气体不能排尽
      灭菌锅最大压力不够不能使管内液体强行把气体挤出，最后会留有小气泡。灭菌锅工作压力不够还会使温度上升缓慢，或达不到灭菌温度。此原因的可能性较小，我们可以在排除原因一、二、三、四的情况下，用不加试管塞、大口导管做试验，若还仍不能达到效果，就需要检查灭菌锅了。
  解决措施：检修灭菌锅，且定期用压力蒸汽灭菌生物指示剂监测灭菌效果。
Q6：培养基的不正确配制会出现哪些异常现象以及可能的原因？
A：异常现象一：培养基不凝固
原因分析：
①制备过程中过度加热；
②低pH造成培养基酸解；
③称量不正确；
④琼脂未完全溶解；
⑤培养基成分未充分混匀。
异常现象二：pH不正确
原因分析：
①制备过程中过度加热；
②水质不佳；
③外部化学物质污染；
④测定pH时温度不正确；
⑤pH计未正确校准；
⑥脱水培养基质量差。
异常现象三：颜色异常
原因分析：
①制备过程中过度加热；
②水质不佳；
③pH不正确；
④外来污染；
⑤脱水培养基质量差。
异常现象四：产生沉淀
原因分析：
①制备过程中过度加热；
②水质不佳；
③脱水培养基质量差；
④pH计未正确控制；
异常现象五：培养基出现抑制/低的生长率
原因分析：
①制备过程中过度加热；
②脱水培养基质量差；
③水质不佳；
④使用成分不正确，如：成分称量不准，添加剂浓度不正确；
⑤制备容器或水中的有毒残留物。
异常现象六：选择性差
原因分析：
①制备过程中过度加热；
②脱水培养基质量差；
③配方使用不对；
④添加成分的加入不正确，例如加入添加成分时培养基过热或添加浓度错误；
添加剂污染。
异常现象七：污染
原因分析：
①不适当的灭菌；
②无菌操作技术存在问题；
③添加剂污染。

（四） 实验过程
Q7：2016版平板法VRBA倾注完，待琼脂凝固后为什么需要加3-4mL的覆盖层？
A：因为大肠菌群是需氧及兼性厌氧的，再加一层琼脂相当于造就一个半厌氧环境，促进兼性厌氧菌的生长，同时抑制其他菌的生长。除此之外，还有防止菌落蔓延的作用，防止迁徙性菌落对菌落计数构成影响。例如一些变形杆菌就会有迁徙现象，从而导致菌落长成一片无法区分。在表面多覆盖一层培养基就可以避免这种情况的发生。
Q8：实验过程中可以引入哪些质量控制，证明此次实验结果有效？
A：1、实验过程中，每批次样品均要做空白对照。若空白对照上有菌落生长，则此次检测结果无效。需从稀释液、吸管、平皿、培养基和实验环境等进行污染来源分析。
2、 无菌室定期进行空气灭菌效果验证（沉降法）
时间：消毒处理后与开展检验活动之前期间采样。
采样点：一般情况下，无菌室面积≤30 m2时，从所设定的一条对角线上选取3点，即中心1点、两端各距墙1m处各取1点；无菌室面积≥30 m2时，选取东、西、南、北、中5点，其中东点、南点、西点、北点均距墙1 m。
方法：将含平板计数琼脂培养基的平板(直径9 cm)置采样点(与地面垂直高度80cm处)，开盖暴露15min后置于36±1℃培养箱培养48±2h。
技术要求：洁净级别100级：≤1CFU/皿；洁净级别10000级：≤3CFU/皿；洁净级别100000级：≤10CFU/皿。
Q9：GB/T 4789.3-2003大肠菌群证实实验中，革兰氏染色过程中会有哪些关键点造成假阳性或假阴性的结果？
A：1、酒精脱色。如脱色过度，革兰氏阳性菌也可被脱色而染成阴性菌；如脱色时间过短，革兰氏阴性菌也会被染成革兰氏阳性菌。脱色时间的长短还受涂片厚薄及乙醇用量多少等因素的影响。
2、染色过程中勿使染色液干涸。用水冲洗后，应吸去玻片上的残水，以免染色液稀释而影响染色结果。
3、选用幼龄的细菌。G+菌培养12-16h，大肠菌群培养24h。若菌龄太老，由于菌体死亡或自溶常使革兰氏阳性菌转呈阴性菌。
Q10：GB 4789.3-2016平板法验证菌落如何挑取？
A：分别计数平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落数。按比例挑取10个不同类型的典型和可疑菌落,少于10个菌落的挑取全部典型和可疑菌落。假如在1:10的平板上可疑大肠菌群有10个，典型大肠菌群有6个。证实实验应该按照可疑跟典型5:3的比例进行挑取，移种于BGLB肉汤管内。

（五）数据处理
Q11：GB 4789.3-2016平板法结果如何计算？
A：1、若最低稀释度(包括液体样品原液)平板的典型菌落数均小于15CFU ，具有确证的菌落数，则以确证的菌落数乘以最低稀释倍数计算；
2、若两个连续稀释度均含适宜的典型菌落数平板，并含有已确证的菌落数，则相应平板均作为计数平板；
3、若两个连续稀释度均含适宜典型菌落数平板，其中某一稀释度的一个平板菌落数不在适宜范围内，或者两个稀释度各有一个平板菌落数不在适宜范围内，则相应的平板不作为计数平板；
4、若两个连续稀释度均含适宜典型菌落数平板，其中一个平板无已确证的菌落数，则相应的平板不作为计数平板；
5、若两个连续稀释度均含适宜典型菌落数平板，但无已确证的菌落数，则以小于1乘以最低稀释倍数计算；
6、若第一稀释度平板上的菌落数超过150CFU，且有证实的菌落数，以及第二稀释度平板上无确证的菌落或典型菌落数不在15CFU~150CFU之间，则以确证的菌落数乘以第一稀释倍数计算。

三、结语
对于结果检出的平板或试管需要经过无害化处理（121℃灭菌30分钟）方能弃去，防止对环境造成污染。