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COL1A2基因多态性与儿童氟斑牙关系

　　作者：黄辉,贾新梅,李世宏,阎平平,程学敏,崔留欣,巴月
【关键词】 I型胶原；氟斑牙；基因多态性
　　摘要： 目的 调查I型胶原α2链PvuⅡ基因型在饮水氟、碘浓度不同地区儿童中的分布，探讨COL1A2 PvuⅡ基因多态性与儿童氟斑牙的关系。方法 采用聚合酶链反应－限制性片段长度多态性方法检测氟碘正常区、单纯高氟区和高氟高碘区8～12岁儿童的COL1A2 PvuⅡ基因型。Dean氏法检查儿童氟斑牙患病情况。结果 3区儿童COL1A2 PvuⅡ基因型在氟碘正常地区分布频率分别为PP233%，Pp367%，pp400%；单纯高氟区分布频率分别为PP98%，Pp451%，pp451%，高氟高碘区分布频率分别为PP137%，Pp384%，pp479%，3区分布差异无统计学意义。儿童氟斑牙患病率分别为0，527%，507%，差异有统计学意义；单纯高氟区和高氟高碘区氟斑牙患病率差异无统计学意义，但高氟高碘区的氟斑牙指数低于单纯高氟区。结论 COL1A2 PvuⅡ基因多态性与所调查儿童氟斑牙无明显关系。
　　关键词： I型胶原；氟斑牙；基因多态性
　　Relationship of COL1A2 polymorphism to children‘s dental fluorosis
　　Abstract： Objective To explore the distribution of collagen type 1 alpha2 (COL1A2)PvuⅡ genotype in children who lived in the high fluoride,high iodine areas,and evaluate the relationship of COL1A2 PvuⅡgene polymorphism to children‘s dental　Polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism technique was used to determine COL1A2 PvuⅡ genotype of the different children lived in the normal fluoride and iodine area ,the high fluoride area,the high fluoride and high iodine　incidence of dental fluorosis was examined using Dean‘s　The distribution frequency of COL1A2 PvuⅡ genotype was %，%，% in the normal fluoride and iodine area,%，%，% in the high fluoride area ,and %，%，% in the high fluoride and high iodine area　were no significant differences in the three areas.The prevalence of dental fluorosis in these three groups was 0，%，% respectively,and there were significant differences in the three areas.There was no significant difference of children dental fluorosis between the high fluoride area and the high fluoride and iodine area,but the community fluorosis index(CFI) in the high fluoride and iodine area was lower than that in the high fluoride　There were no correlation between COL1A2 PvuⅡgene polymorphism and the dental fluorosis in the three areas.
　　Key words： collagen type I；dental fluorosis；gene polymorphism

　　I型胶原是骨组织中唯一的胶原，由2条α1链和1条α2链组成,分别由Ⅰ型胶原α1链(COL1A1)和Ⅰ型胶原α2链(COL1A2)基因编码。Ⅰ型胶原基因的多态性多种多样，其基因的突变可导致很多疾病。近年来对它的研究主要集中在先天遗传疾病上〔1〕。随着环境基因组计划启动，越来越多的研究表明，骨组织的损伤反应不仅与暴露于环境有害因素的程度有关，同时还与遗传易感性或耐受性有着密切联系〔2-4〕。而有关COL1A2基因多态性的分布及其与氟斑牙发生发展关系报道较少。本次研究通过环境流行病学调查，采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法，分析Ⅰ型胶原α2链PvuⅡ各基因型在地氟病区儿童中的分布，探讨该位点基因多态性与儿童氟斑牙的关系，为地氟病防治提供基础资料。
　　1 对象与方法
　　11 对象 根据水氟和水碘监测资料，选择通许县某村作为单纯高氟区，平均水氟浓度18mg/L,平均水碘浓度918μg/L；选择开封县某村作为高氟高碘区，平均水氟浓度31mg/L，平均水碘浓度2913μg/L；另选择自然状况、经济条件、人口构成农作物种类、生活习惯等条件均与高氟区相似，平均水氟浓度10mg/L,平均水碘浓度637μg/L的通许县坡于村作为对照区。选择在当地居住5年以上8～12岁汉族儿童作为研究对象，经体检排除肝、肾功能异常、遗传疾病患者及接受钙剂、氟化物、激素替代治疗者；其中氟碘正常区60名，单纯高氟区74名，高氟高碘地区73名。
　　12 氟斑牙检查及结果判定 分别进行儿童氟斑牙检查，根据知情同意的原则，抽取外周血进行基因多态性分析。由口腔科执业医师和地氟病防治公共卫生执业医师按照Dean‘s级分类法诊断氟斑牙〔5〕。以氟斑牙患病率和氟斑牙指数为统计指标。氟斑牙患病率=×100%氟斑牙指数(CFI)=〔++++〕/受检查人数
　　13 主要试剂 全血基因组DNA提取试剂盒；Taq DNA聚合酶、三磷酸脱氧核苷(dNTP)Mixture；限制性内切酶PvuII(立陶宛，MBI)；引物序列由上海生物工程公司合成。
　　14 COL1A2 PvuⅡ基因多态性分析 COL1A2序列从GeneBank上检索得到，PCR扩增片段长度为584bp，上游引物为：5′-GGAAATATCGGCCCCGCTGGAAA-3′，下游引物为：5′ -GTCCAGGGAATCCAATGTTGCCA-3′。PCR扩增反应体系为50μl，含模板DNA60μl、10×buffer50μl、10pmol/L的上下游引物、50μmol/L的dNTP、20mmol/L的MgCl2和Taq酶25U。扩增条件为：94℃预变性5min，94℃ 50s，55℃ 50s，72℃ 60s，循环5次。然后94℃ 50s，60℃ 50s，72℃60s，循环25次，72℃末端延伸7min。PCR产物经限制性内切酶PvuII在37℃下水浴6h，PCR产物经18%琼脂糖凝胶电泳。以PvuⅡ内切酶的第一个字母做标记，可分为3种基因型：PP、Pp和pp，其中p表示被切开，P表示未被切开。
　　15 统计分析 采用SPSS120统计软件进行四格表及列联表资料的χ2检验，以α＝005为检验水准。

　　2 结果
　　21 儿童外周血COL1A2 PvuⅡ基因多态性结果
　　211 3区儿童COL1A2 PvuⅡ3种基因型的分布(图1，图2，表1)注：M：DL2000 Marker；4：为阴性对照；1，2，3，5，6，7：PCR阳性产物图1 PCR扩增产物注：M：100bp DNA ladder；p：被切开；P：未被切开图2 COL1A2 PvuⅡ酶切结果表1 不同地区儿童COL1A2 PvuⅡ基因型的分布由表1可见，3个地区儿童COL1A2 PvuⅡ3种基因型之间的分布差异无统计学意义。
　　212 COL1A2 PvuⅡ3种基因型在不同性别中的分布 男性儿童3种基因型的分布频率分别为PP140%，Pp449%，pp411%；女性儿童的分布频率分别为PP165%，Pp350%，pp485%，各基因型在不同性别中分布差异无统计学意义
　　22 COL1A2 PvuⅡ基因多态性与氟斑牙的关系
　　221 不同地区儿童氟斑牙患病率及氟斑牙指数比较(表2)表2 不同地区儿童氟斑牙患病率及氟斑牙指数比较3个地区氟斑牙患病率差异有统计学意义，且2个高氟区的氟斑牙指数明显高于正常地区。进一步对单纯高氟区和高氟高碘区做四
　　格表χ2检验，χ2＝0060，P＝0807005，结果表明，单纯高氟区和高氟高碘区的氟斑牙患病率差异无统计学意义。
　　222 COL1A2 PvuⅡ基因多态性与氟斑牙的关系 氟斑牙儿童3种基因型的分布频率分别为PP187%，Pp320%，pp493%；非氟斑牙儿童3种基因型的分布频率分别为PP132%，Pp450%，pp419%，氟斑牙和非氟斑牙儿童各基因型的分布差异无统计学意义。
　　3 讨论
　　本研究结果显示，3个地区儿童COL1A2 PvuⅡ酶切位点各基因型的分布频率与氟病区成年人该位点基因型分布频率相似〔6〕，同时与Suuriniemi等〔7〕对芬兰未成年女孩和Lau〔8〕对中国香港老年人研究的基因型分布频率相同。比较各基因型在不同性别儿童中的分布频率，差异也无统计学意义。以上结果表明，COL1A2 PvuⅡ基因型在不同地区、不同性别人群中分布比较稳定，以突变型为主。本研究结果显示,3个地区儿童COL1A2 PvuⅡ各基因型分布频率差异无统计学意义，但儿童的氟斑牙患病率差异有统计学意义；氟斑牙和非氟斑牙儿童各基因型的分布差异也无统计学意义，说明COL1A2 PvuⅡ基因多态性与该地区儿童氟暴露所致氟斑牙无明显的关联。但各基因型分布频率显示，PP基因型在单纯高氟、高氟高碘及对照区的比例呈逐渐升高趋势，氟碘正常区儿童中野生基因型比例较高。是否与暴露高氟可诱导COL1A2 PvuⅡ位点的碱基突变，而适量碘可抑制突变基因型的发生有关，还需通过进一步分析不同氟碘暴露水平儿童的基因多态性来证实。本研究中，单纯高氟区和高氟高碘区儿童氟斑牙患病率差异无统计学意义，但从水氟测定结果来看，单纯高氟区水氟浓度为18mg/L，属轻病区，高氟高碘区水氟浓度为31mg/L属中等病区，而单纯高氟区氟斑牙患病率已达到中等病区水平，且氟斑牙指数高于氟碘联合作用区。这说明氟碘联合作用区儿童所患氟斑牙的严重程度略低于单纯高氟区，该结果显示，碘可能对高氟引起氟斑牙有一定的抑制作用，这与洪福贵〔9〕等的高氟高碘2个因素同时存在时，其危害性更严重的报道不一致。但该文献中水碘浓度为1508μg/L，远高于本调查点的水碘浓度，提示适量的碘可能抑制氟的内分泌干扰作用〔10〕，碘过高则起到相反的作用。氟碘联合作用对儿童所产生的影响有待于进一步探讨。
　　参考文献
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　　〔7〕 Suuriniemi M,Mahonen A,Kovanen V,et　of PvuII site polymorphism in the COL1A2 gene to the risk of fractures in prepubertal Finnish girls［J］.Physiol Genomics,2003,14(7):217-224.
　　〔8〕 Lau EM,choy DT,Li M,et　relationship between COLIA1 polymorphisms (Sp 1) and COLI A2 polymorphisms (Eco R1 and Puv II) with bone mineral density in Chinese men and women［J］.Calcif Tissue Int,2004,75(4):133-137.
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