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四环素及其衍生物诱导表达的pTetOn肺癌细胞系A549的建立
【摘要】　目的：构建可受四环素诱导调控的高表达外源基因的真核表达体统A549 pTetOn细胞系。用于F10基因的功能研究。方法：将pTetOn质粒用脂质体介导法转染A549细胞, 利用G418的药物选择特性, 对转染的A549细胞进行压力筛选后的克隆用有限稀释法进行单克隆化, 单克隆分别扩增后, 瞬时转染pTREluc(编码荧光素酶蛋白)质粒, Dox诱导表达后, 检测荧光素酶活性, 逐一筛选四环素调控高表达外源基因的A549 pTetOn细胞株。结果：成功构建了一株受Dox调控的高表达低背景的A549 pTetOn细胞株。结论：筛选的A549细胞为F10基因表达能被pTeton诱导表达系统调控的细胞系, 为研究F10基因功能提供了理想的细胞模型。适合在此基础上对F10基因进行深入的研究。
【关键词】　四环素; F10基因; 基因调控
F10基因是新克隆的在葡萄胎中表达上调的功能未知的新基因［1］，在大多数基因 治疗 或研究基因功能时, 多数转基因都是持续表达的, 没有表达量和表达时间的调控。很多情况下, 这种持续表达外源基因不论是基因功能研究还是基因治疗都存在很大局限。pTetOn基因表达系统是1992年Gossen［2］等设计的一种受四环素调控外源基因表达的高效真核表达体系，该系统有两种表达质粒即调节质粒和反应质粒组成, 调节质粒可表达一种融合蛋白称四环素反应转录活化因子(Tetresponsivetranscriptionalactivator,tTA), 该因子可与反应转录的四环素反应性元件(Tetresponsiveelement,TRE)结合。在没有四环素(tetracycline)或其衍生物强力霉素存在的情况下, 引起插入启动子下游目的基因的高效表达。随着四环素浓度的增加, 基因的表达以一种剂量依赖性的方式逐渐关闭直至为零。1995年Gossen等通过改变tTA的氨基酸顺序构建了受四环素正性调节的基因表达系统, 称Teton基因表达系统。该系统受四环素的作用刚好与Tetoff系统相反, 即在没有四环素的情况下表达水平为零。而在加入四环素或强力霉素后目的基因高效表达。Tetoff、Teton基因表达系统被认为是目前最为理想的真核生物基因表达系统。与目前所有的真核基因表达系统比较, 该系统具有严密性、特异性、高效性等优点［3］。基于此系统的原理，我们将pTeton基因表达系统的调节质粒pTeton转染到A549细胞系，筛选得到稳定克隆后，再导入报道质粒pTRELuc, 通过检测荧光素酶的活性，筛选、建立了一株能高水平诱导、低背景表达的A549细胞系，为下一步研究F10基因的定量表达在肿瘤的发生、　中的作用提供理想的细胞模型。
　1 材料与方法
　质粒
pTetOn 、pTRELuc、DOX、Lipofectamin2000、无四环素污染的胎牛血清购自Clongtech公司。G418、DMEM购自Gicol公司，Luciferase Assay System为Promega公司的产品。
　细胞系及培养条件
肺癌细胞系A549培养于含10%胎牛血清的RPMI1640的培养基中，在37℃、5% CO2条件下培养。
　建立表达pTetOn的稳定克隆
Lipofectamin2000介导的稳定转染：转染前24h细胞种于6孔板，待细胞生长至90%～95%的融合度时开始转染。转染时备两个Eppendorf管，每管加入250μl无血清的RPMI1640培养液，其中的一管再加pTetOn质粒3μg,另一管加入Lipofectamin2000 8μg，待Lipofectamin2000室温孵育5min后，混合两管，室温放置5min。然后将500μl混合液加于2mL完全培养基6h, 更换培养基继续培养至克隆形成, 挑选单克隆，经过96孔、24孔及12孔细胞培养板传代至25ml培养瓶，然后扩大培养备用。
　质粒pTRELuc瞬间转染A549细胞
用有限稀释法将稳定转染pTetOn的A549克隆(A549 pTetOn)单克隆化。用%胰酶消化A549 pTetOn克隆, 制成30个/ml的细胞悬液接种于10块96孔板, 每孔接种100μl细胞悬液。2周后挑选生长状况良好的单克隆(克隆编号)从96孔板逐步扩增到6孔板里; 细胞丰度达90%时, 将每孔的细胞消化后平均接种在两个直径为35mm的培养皿里, 分别记作A和B, A皿细胞保种; 用脂质体法将pTREluc质粒转染B皿细胞, 48h后将转染的B皿细胞消化平均接种在两个535mm的培养皿里, 分别记作B1和B2。B1皿细胞培养在含有1μg/ml Dox的全培液里, B2皿细胞不加Dox作对照, 48h后检测荧光素酶活性。
　荧光素酶活性检测
按Luciferase Assay System 的说明书的方法，用PBS洗24孔板中待分析的细胞2次，然后每孔加入100μl, 收集细胞裂解液，置于冰上，旋涡震荡15s，4℃,12000rpm 2min, 每个样品取10μl蛋白裂解液，加入50μl Luciferase Assay Reagent, 迅推入单光子仪中测定2s荧光素酶，延迟时间为10s。
　诱导倍数 计算
诱导倍数按下列公式计算:诱导倍数=+Dox/-Dox诱导倍数20者为高表达克隆。
　2 结果
　A549 TetOn
单一克隆的建立Lipofectamin2000介导转染pTetOn后，由于质粒带表达neo基因的G418抗药性，加入G418筛选, 1周后对照组细胞全部死亡而转染pTetOn的克隆开始出现, 说明转染成功; 2周后抗性克隆隆轮廓清晰, 克隆与克隆间的零散细胞几乎全部死亡, 表明都为稳定转染pTetOn的A549克隆, 命名为A549 pTetOn细胞。有限稀释法将A549 pTetOn细胞进行单克隆化。1星期后96孔里克隆出现, 显微镜下逐孔观察, 排除多克隆的孔, 标记单克隆的孔并编号, 共挑出10个单克隆, 编号从～。
　　　高诱导倍数的A549 pTetOn克隆的挑选
A549 pTetOn细胞通过瞬时转染荧光素酶基因进行筛选。分别将pTREluc质粒瞬时转染10个A549 pTetOn克隆, 通过分析荧光素酶活性从中挑选出1株高诱导低背景表达的细胞株即8号, 导倍数为, 名为A549 pTetOn (2)。从图2中看出A549 TetOn转染pTREluc后, 对照组(不加Dox)荧光素酶活性很低, 即表达较低水平的外源基因；实验组荧光素酶活性较高, 即高表达外源基因。从图3看出A549 TetOn诱导倍数最高为。所以8号即为我们需要的低背景高表达的细胞株。
　3 讨论
随着人类基因组的顺利完成，越来越多的新基因被发现并定位。基因功能研究成为生命 科学 领域的重大课题。这一领域研究是生物技术产业和健康产业的, 蕴藏着巨大的产业化潜能和　效益, 并与人类的健康息息相关。但如何对新基因的功能进行研究却是一个棘手的问题，其中如何定时定量表达特定基因来研究不同表达水平下的作用一直是一个难题。传统调控基因表达的方法常依赖于热休克、激素或重金属等的基因表达诱导系统, 但由于这些系统存在高本底和多嗜效应等缺陷, 极大地限制了它们的和　［4,5］。近年来发展的四环素调控系统克服了上述不足。Tetoff、Teton系统是20世纪90年代以来Gossen和Bujard等创建的一种利用原核调控元件在真核细胞中定量并特异地控制外源基因表达的体系。该体系由大肠杆菌Tn10转座子中四环素阻遏操纵子的两个部件(四环素阻遏蛋白和四环素操纵子序列与四环素及其衍生物doxycycline(Dox)组成。具有如下优点：① 可调控性：四环素为外源基因表达的开关, 调控外源基因的表达； ② 专一性： 由于其调控元件为原核生物调控序列,不调控真核生物内源性基因的表达；③ 诱导剂廉价无毒副作用；④ 诱导时间短, 无泄漏表达且表达量高, 表达量远远高于CMV启动子［6］。Teton系统具有快速激活基因, 诱导动力学受体内Tet的影响相对较小, 能更精确的进行目的基因的调控, 使用更为方便经济。所以,Teton系统已被成功的应用于哺乳动物细胞培养、转基因鼠、基因 治疗 ［7～10］。本研究将pTeton基因转染A549细胞后, G418筛选8～10d后形成Teton阳性克隆, 由于pTeton基因中表达转录调控蛋白(r)tTA在A549细胞中整合位点的不同, 导致不同阳性克隆表达(r)tTA蛋白的量存在很大差异, 只有高表达(r)tTA的阳性克隆才有可能有较高的诱导表达倍数［11］。因此, 我们利用质脂体通过瞬时转染荧光素酶基因(pTREluc)对筛选出的Teton阳性克隆进行功能鉴定, 用以筛选出具有高诱导、低背景的Teton基因阳性A549 细胞株, 在Dox的作用下筛选出8号为高诱导且低背景的阳性A549细胞株, 从图2、图3中可见不同的细胞株在dox的作用下荧光素酶表达存在很大差异,其中8号诱导倍数为倍, 其诱导倍数大于20倍, 所以8号细胞株为较理想的诱导细胞株。如果将目的基因导入该细胞株, 将可能表现出较低的背景和20倍以上的目的基因诱导表达。有 文献 报道Teton系统可使诱导表达的目的基因表达量增高100倍, 甚至增高1000倍［12］, 在我们的试验中获得最高诱导表达倍数的A549克隆株为倍, 分析原因可能与所使用的荧光素酶检测试剂盒，基因整合位点，细胞类型等差异有一定的关系, 这有待于今后做进一步的研究。我们已初步成功的建立了Teton稳定表达的A549细胞株, 对于深入研究F10基因的生理功能和机制、全面阐述其生物学意义均具有十分重要的理论和应用价值。
【 参考 文献】
　　1 李贵堂,庞战军，周瑾等.葡萄胎发病相关新基因的克隆广东.2006,27:22～24.
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　　7 张晶,王泓威,吴宁华,等.JurkatTeton细胞系的建立.科学通报，1999，23：2524～2527.
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　　11 Wang Y,O,Malley BW Jr,Tsai SY,et　regulatory system for using gene transfer. PNAS USA,1994,91:8180～8184.
　　12 Zhang Y,Katakura Y,Ohashi H,et　autocatalytic expression system for regulated production of regulated production of recombinant protn in mammalian　Bionchem,1997,252(2):286～292.