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CACNA1F基因在3T3【摘要】 目的 观察3T3-L1前体脂肪细胞诱导分化过程中L-型电压依赖钙离子通道1F亚基(CACNA1F)基因表达水平的变化，探讨CACNA1F基因与肥胖发生的关系。方法 体外培养3T3-L1前体脂肪细胞，在诱导3T3-L1脂肪细胞分化成熟的不同时段，采用RT-PCR技术检测脂肪细胞中CACNA1F基因的mRNA表达水平。结果 CACNA1F基因在脂肪前体细胞中表达水平较低，随着脂肪细胞的分化成熟该基因表达水平逐渐升高，至分化第810天达到高峰。进一步的统计分析发现，CACNA1F基因的表达水平在细胞分化第03天、56天、810天3个时间段内无明显变化外(P)，其余各时间段之间的表达水平差异均有显着性(P)。结论 CACNA1F基因参与了脂肪细胞分化的调控，与肥胖发生相关，其在3T3-L1细胞分化过程中的表达变化可能有利于脂肪细胞的分化成熟和脂质积聚。 【关键词】 CACNA1F基因 3T3-L1前体脂肪细胞 细胞分化. 【Abstract】 Objective To investigate the changes of L-type voltage-dependent calcium channel 1F(CACNA1F)gene expression during 3T3-L1 preadipocyteexplore the relationship between CACNA1F gene and the etiology of3T3-L1 preadipocytes were cultured in vitro and differentiated into the maturedRNA was extracted from adipocytes of various times and the levels of CACNA1F gene mRNA expression were evaluated byIn preadipocye，the levels of CACNA1F gene mRNA expression remained atthe presence of inducing reagents，the CACNA1F gene mRNA expression was induced at a very early stage and remained at high levels in the maturewas a significant difference between any two detected phases in the levels of CACNA1F gene mRNA expression ，except that the levels of CACNA1F gene mRNA expression did not increase obviously in day 0 to 3 day，5th to 6th day，8th to 10thCACNA1F gene is involved in the differentiation of adipocytes and related to the etiology ofchanges in the level of CACNA1F gene mRNA expression during 3T3-L1 preadipocyte differentiation might be contributing to the differentiation and adipogenesis of adipocytes. 【Key words】 L-type voltage-dependent calcium channel 1F gene 3T3-L1 preadipocyte cell differentiation 近年来，我国儿童肥胖的发病率逐渐上升，而且与肥胖相关的一些疾病，如高血压、高脂血症、2型糖尿病等越来越多地出现在儿童群体中，肥胖已成为危害儿童身心健康的严重医学问题；然而肥胖病因复杂，是机体在遗传、环境、行为、生理、社会、文化等诸多因素相互作用下能量代谢失衡的结果，因此防治难度极大，一些传统的肥胖治疗方法如控制饮食、减肥药物等收效甚微，而且由于儿童正处于身心发育的关键时期，这些方法在儿童中的应用受到限制，因此迫切需要寻找安全有效的肥胖控制治疗方法。钙是饮食中一种重要的成分，自从十多年前人们发现肥胖病人体内脂肪细胞中钙离子浓度升高以来，钙与肥胖的关系逐渐成为一个研究热点，为寻找控制肥胖及其相关疾病的治疗方法开拓了一片崭新的视野。研究表明，细胞内钙离子浓度在与肥胖相关的能量代谢失衡中起关键作用。细胞内钙离子在调控脂肪细胞脂质代谢和甘油三酯沉积中起着重要作用，细胞内钙离子浓度的增加导致脂肪合成基因的表达和脂肪合成的增加、抑制脂肪分解，最终增加脂肪积聚而导致肥胖。低钙饮食可导致1，25-二羟维生素D3的产生增加，刺激钙离子在细胞内流动从而促进肥胖的发生；而高钙饮食可以减少脂肪细胞脂质积聚，增加脂质分解，控制体重增加1，2。在这个过程中，钙离子通道介导的钙离子细胞内流是一个重要环节。因此围绕着钙离子通道及其调控因素开展进一步的研究具有重要的意义。由于在先前研究中3，应用cDNA array技术发现，L型电压依赖钙离子通道1F(L-type voltage-dependent calcium channel 1F，CACNA1F)基因差异表达于肥胖和正常大鼠的脂肪组织中，肥胖状态下该基因表达显着上调，提示该基因表达变化与肥胖发生密切相关。为进一步研究该基因与肥胖之间的关系，本研究在成功诱导3T3-L1前体脂肪细胞分化成熟的基础上，采用RT-PCR技术观察CACNA1F基因在前体脂肪细胞向成熟脂肪细胞分化过程中表达水平的变化，以探讨该基因与脂肪细胞分化及肥胖之间的关系。 1 材料与方法 材料 3T3-L1前体脂肪细胞株由上海中科院生物化学与细胞生物学研究所廖侃教授馈赠，本实验室传代留种，DMEM培养基、胰蛋白酶、TRIzol购自美国Invitrogen公司，胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)购自杭州四季青生物工程材料有限公司，胰岛素、地塞米松、1-甲基-3-异丁基黄嘌呤(MIX)、DEPC购自美国Sigma公司，油红O(oil red-O)染料购自上海化学试剂厂。dNTP、M-MLV逆转录酶、Oligo(dT)18、Ex-Taq酶等分子生物学试剂购自美国Promega公司，PCR Marker购自华美生物工程公司，引物由上海捷倍思基因技术有限公司合成。 方法 3T3-L1前体脂肪细胞培养和诱导分化 根据3T3-L1细胞培养和诱导分化方案4，用完全培养液(DMEM+10%FBS+100u/ml青、链霉素)，在37孵箱(5%二氧化碳，95%空气)中培养细胞，每2天换液1次。待细胞生长至完全融合后2天(第0天)，开始诱导分化，具体步骤为：将培养液换成含/L MIX、1mol/L地塞米松和5mg/L胰岛素的完全培养液；48h后，撤去MIX和地塞米松，使完全培养液中只含有5mg/L胰岛素；2天后换液，撤去胰岛素，使用不含有任何诱导剂的完全培养基；以后每2天换液1次，直至第10天95%以上细胞已分化为成熟的脂肪细胞。收集分化不同时间段(010天)的细胞，置-70冻存备用。 3T3-L1细胞鉴定 油红O染料经异丙醇溶解后过滤，置4备用。取分化不同时间段(010天)的细胞，先用 PBS洗2遍，加入%甲醛固定2min，再用清水洗净，加入油红O染液染1h，水洗至背景透明。经油红O染色、苏木素复染，显微镜下观察结果，细胞质中脂滴呈亮红色、细胞核呈蓝色。拍照，记录细胞的分化情况。 RT-PCR方法检测3T3-L1细胞中CACNA1F基因mRNA的表达水平 取细胞200l(约4105个细胞)，TRizol法提取3T3-L1细胞的总RNA，定量后取1g，以Oligo(dT)18为引物进行逆转录，反应体系20l。取逆转录产物1l为模板进行PCR扩增，PCR反应体系20l。小鼠CACNA1F基因的上游引物序列：5-ATC ATC ATC TTC TCC CTG CT-3，下游引物序列：5-CAC CAC ATG CTT GAG TCC CT-3，产物长度987bp；内参照小鼠GAPDH基因的上游引物序列：5-ACC ACA GTC CAT GCC ATC AC-3，下游引物序列：5-TCC ACC ACC CTG TTG CTG TA-3，产物长度432bp。PCR反应条件为：预变性95 2min，变性94 30s，退火52 30s(GAPDH基因：52 30s)，延伸72 30s，共30个循环(GAPDH基因：30个循环)，终末延伸72 5min。所选用PCR反应的模板量及循环数均使PCR产物量位于反应曲线的线性范围内。PCR产物经%琼脂糖凝胶电泳后，用UVP凝胶密度扫描仪对CACNA1F基因和CAPDH特异性扩增产物的电泳条带进行密度扫描，用Labwork 软件测定电泳条带密度值，CACNA1F基因mRNA的表达水平以该基因条带密度占GAPDH基因条带密度的百分比(%)表示。 统计学方法 数据均以均数标准差(xs)表示，用Excel统计软件和SPSS 统计软件进行数据整理和统计。多组间均数比较采用方差分析F检验，组间两两比较采用q检验，P示结果具有统计学意义。 2 结果 细胞染色鉴定结果 诱导分化前，3T3-L1前体脂肪细胞呈梭形成纤维细胞形态，细胞核呈蓝色，细胞质内未见亮红色颗粒；细胞生长至完全融合后2天(第0天)开始诱导分化，第2天到第6天细胞形态发生明显变化，细胞逐渐由梭形变为圆形，胞体变大变圆，细胞质内被油红O染成亮红色的脂滴逐渐增多增大；第6天时，约60%的细胞已分化成熟；第10天时，可见含有亮红色脂滴的成熟脂肪细胞在视野中占95%以上，细胞体积大、形态圆。 3T3-L1脂肪细胞诱导分化过程中CACNA1F基因表达水平的变化 见图1、图2、表1。由图表可见，CACNA1F基因在脂肪前体细胞中表达水平较低，随着脂肪细胞的分化成熟该基因表达水平逐渐升高，至分化第810天达到高峰。进一步的统计分析发现，CACNA1F基因的表达水平在细胞分化第03天、56天、810天3个时间段内无明显变化外(P)，其余各时间段之间的表达水平差异均有显着性(P)。 图1 3T3-L1脂肪细胞分化中CACNA1F基因表达水平的检测(M：PCR Markers，010：细胞分化时间) 图2 3T3-L1脂肪细胞分化中CACNA1F基因表达水平的变化 表1 3T3-L1细胞诱导分化过程中CACNA1F基因的表达水平 (xs，%) 注：与第510天各组比较：P均；与第5天比较：P；与第610天各组比较：P均；与第6天比较：P；与第710天各组比较：P；与第7天比较：P；与第810天各组比较：P均；细胞数约4105 3 讨论 CACNA1F基因编码L型电压依赖型钙离子通道的一种1亚基1F，既往研究发现其主要表达于视网膜光感受器细胞上，介导钙离子细胞内流，该基因的突变可导致人类遗传性不完全性联夜盲症(incomplete X-linked congenital stationary night blindness，iCSNB2)5。L型钙离子通道由1、2、等多条多肽亚基组成，其中1亚基是最重要的功能单位，它形成钙离子跨膜流通的孔洞通道，既具有离子选择性，又是电压感受器，同时也是钙拮抗剂等大多数药物的结合位点；位于膜内的亚基、位于膜外的2亚基及跨膜的亚基共同组成钙离子通道的附属部分，起着调控钙离子通道的作用68。1有多种类型，由1F亚基组成的钙离子通道又被命名为9。具有以下一些功能特点：它激活快、失活较慢、激活的阈电位较低、对DHP(dihydropyridine，二氢嘧啶，一种钙离子通道拮抗剂)的中度敏感性以及没有Ca2+诱导的失活过程10。 本研究通过3T3-L1脂肪前体细胞体外培养研究首次发现，CACNA1F基因也表达于3T3-L1脂肪前体细胞的诱导分化过程中，并且随着细胞的分化成熟，其表达水平之间增高，而且其表达增高的趋势与细胞脂质积聚过程呈现较好的一致性。由此现象推测，CACNA1F基因的功能与脂肪细胞的成熟及脂质积聚有关，即该基因参与了脂肪细胞的分化过程。随着脂肪前体细胞的分化进程，CACNA1F基因的表达逐渐上调，细胞膜表面钙离子通道的数量逐渐增加，其介导的钙离子内流增加，细胞内钙离子浓度上升，促进了脂肪细胞的分化以及脂质积聚。进一步的统计分析发现，CACNA1F基因在细胞分化的03天表达水平并无明显变化。至35天时其表达水平才开始有显着上升，这可能与03天时细胞尚处于克隆性增殖阶段(DNA复制阶段，将提供 1 Zemel MB，Millercalcium and dairy modulation of adiposity and obesityRev，2004，62(4)：125-131. 2 Zemeland endocrine modulation of 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