快速检测食品中微生物方法的进展.docx

快速检测食品中微生物方法的进展
【摘要】 快速检测食品中微生物的方法在食品卫生检验方面起着越来越重要的作用，最终将达到预防肠道传染病和食物中毒的发生的目的。快速方法包括即用型纸片法、生物化学技术、选择鉴定用培养基法、免疫学技术、细菌直接计数法、全自动微生物分析系统等。本文对上述各种快速检测食品中微生物的方法的研究进展作一综述。
【关键词】 快速检测；食品；微生物
　　Progress of the Quick Inspection Methods of Microorganisms in the Food
　　Abstract: These quick inspection methods play a more and more important role in the food hygiene．and will achieve the purpose of prevent the contagions of alimentary canal and bacterial food poisoning in finally. The quick inspection methods of microorganisms in the food include quick inspection paper, molecular biology detection methodchoose appraisal medium method, immunology method, bacterium direct counting method，automatic microbial monitoring system etc． This article has summarized the quick inspection methods of microorganisms in the food.
　　Key words: Quickinspection；Food；Microorganism
　　随着人们生活水平不断提高，食品安全问题越来越受到人们的重视，微生物对食品的污染问题也相应地备受关注。在食品生产、加工、储存、运输、销售等各个环节中都有污染微生物的可能。一旦污染，微生物将大量繁殖而引起食品腐败变质，或导致食源性感染和食物中毒。特别是近年来随着环境污染的加剧和生态平衡的不断破坏，可导致人类感染的致病菌的种类越来越多，病原微生物对人类的威胁越来越大。传统的检验方法，主要包括形态检查和生化方法，其准确性、灵敏性均较高，但涉及的实验较多、操作烦琐、需要时间较长、准备和收尾工作繁重，而且要有大量人员参与［1，2］。所以，准确、省时、省力和省成本的快速检验方法是社会的迫切需要。本文对食品中微生物的快速检测方法进展情况进行综述，以利于对食品进行筛选和检测，最终达到预防肠道传染病和食物中毒的发生的目的。
　　1 即用型纸片法
　　3M公司的perrifilmTMPlate系列微生物测试片，可分别检测菌落总数、大肠菌群计数、霉菌和酵母计数［3］。由RCP Scientific Inc 公司开发上市的Regdigel系列，除上述项目外还有检测乳杆菌、沙门菌、葡萄球菌的产品［3］，这两个系列的产品与传统检测方法之间的相关性非常好。如用大肠菌群快检纸片检测餐具的表面，操作简便、快速、省料，特异性和敏感性与发酵法符合率高，已经被列为国标方法。使用时应正确掌握操作技术和判断标准，从而达到理想的检测效果［4］。美国3M公司生产的PF(Petrifilm)试纸还加入了染色剂、显色剂，增强了菌落的目视效果，而且避免了热琼脂法不适宜受损细菌恢复的缺陷。在大肠菌群检测方面，国标方法报告的是MPN值而不是每克食品中的大肠菌群数，PF法则可以得出精确数据［1］。霉菌快速检验纸片，应用于食品检验中的霉菌具有操作简便，仅需36℃培养，不需要低温设备；快速，仅需2 d就可观察结果，比现在的国家标准检验方法缩短3 d～5 d，大大提高了工作效率。纸片法与国标法在霉菌检出率上差异无显着性，且菌落典型，易判定。纸片荧光法利用细菌产生某些代谢酶或代谢产物的特点而建立的一种酶底物反应法。只需检测食品中大肠菌群、大肠杆菌的有关酶的活性，将荧光产物在365 nm紫外光下观察即可。同时纸片可高压灭菌处理，4℃保存，简化了实验准备、操作和判断［6］。
　　2 生物化学技术
　　PCR技术 PCR技术采用体外酶促反应合成特异性DNA片段，再通过扩增产物来识别细菌。由于PCR灵敏度高，理论上可以检出一个细菌的拷贝基因，因此在细菌的检测中只需短时间增菌甚至不增菌，即可通过PCR进行筛选，节约了大量时间，但PCR技术也存在一些缺点：食物成分、增菌培养基成分和其他微生物DNA对Taq酶具有抑制作用，可能导致检验结果假阴性；操作过程要求严格，微量的外源性DNA进入PCR后可以引起无限放大产生假阳性结果；扩增过程中有一定的装配误差，会对结果产生影响。最近，美国快力康公司推出了全球第一台PCR全自动检测仪BAX系统，克服手工操作PCR的缺点，能用于检测细菌，敏感性和特异性都非常好［7］。
　　基因探针技术 基因探针技术利用具有同源性序列的核酸单链在适当条件下互补形成稳定的DNARNA或DNADNA链的原理，采用高度特异性基因片段制备基因探针来识别细菌。基因探针的优点是减少了基因片段长度多态性所需要分析的条带数。如法国生物一梅里埃公司的GENPROBE基因探针检测系统，对于分离到的单个菌落，30 min完成微生物的确证试验［7］，基因探针的缺点是不能鉴定目标菌以外的其他菌。
　　3 选择、鉴定用培养基法
　　在培养基中加入特异性的生化反应底物、抗体、荧光反应底物、酶反应底物等，可使目标培养物的选择、分离、鉴定一次性完成。如生物一梅里埃公司的BP+RPF(兔血浆+纤维蛋白原)培养基，可在24 h内鉴定金黄色葡萄球菌［8］。Merk公司的chromocult Coliform Agar培养基上，大肠杆菌为墨绿色至紫色菌落，沙门菌为淡绿色至蓝绿色菌落。柠檬酸杆菌和克雷伯杆菌为橙红色至红色菌落，其他肠道菌为无色菌落［9］。
　　4 免疫学技术
　　免疫学技术通过抗原和抗体的特异性结合反应，再辅以免疫放大技术来鉴别细菌。免疫方法的优点是样品在进行选择性增菌后，不需分离，即可采用免疫技术进行筛选。由于免疫法有较高灵敏度，样品经增菌后可在较短的时间内达到检出度，抗原和抗体的结合反应可在很短时间内完成［10］。如采用免疫磁珠法可有效地收集、浓缩神奈川现象阳性的副溶血性弧菌，可显着提高环境样品及食品中病原性副溶血性弧菌的检出率［11］。胶体金免疫层析法能快速、灵敏检测金黄色葡萄球菌［12］，应用胶体金免疫层析法检测食品中的沙门菌，简便快速，无需特殊仪器设备，适合现场检测之用［13］。ATP生物发光法是近年发展较快的一种用于食品生产加工设备洁净度检测的快速检测方法。利用ATP生物发光分析技术和体细胞清除技术，测量细菌ATP和体细胞ATP， 细菌ATP的量与细菌数成正比，用ATP生物发光分析技术检测肉类食品细菌污染状况或食品器具的现场卫生学检测，都能够达到快速适时的目标［14，15］。微型自动荧光酶标分析法(mini VIDAS)是利用酶联荧光免疫分析技术，通过抗原抗体特异反应，分离出目标菌，由特殊仪器根据荧光的强弱自动判断样品的阳性或阴性。VIDAS法检测冻肉中沙门菌具有很高的灵敏度和特异性，用于进出口冻肉的检测，可大大缩短检验时间，加快通关速度［16］，检测冻肉中李斯特氏菌亦如此［17］。
　　5 细菌直接计数法
　　主要包括流式细胞仪(flow cytometry，FCM)和固相细胞计数(solid phase cytometry，SPC)法。FCM通常以激光作为发光源，经过聚焦整形后的光束垂直照射在样品流上，被荧光染色的细胞在激光束的照射下产生散射光和激发荧光。光散射信号基本上反映了细胞体积的大小；荧光信号的强度则代表了所测细胞膜表面抗原的强度或其核内物质的浓度，由此可通过仪器检测散射光信号和荧光信号来估计微生物的大小、形状和数量。流式细胞计数具有高度的敏感性，可同时对目的菌进行定性和定量［18］。目前已经建立了细菌总数［19］、致病性沙门菌、大肠埃希氏菌［20］等的FCM检验方法。固相细胞计数可以在单个细胞水平对细菌进行快速检测［21］。滤过样品后，存留的微生物在滤膜上进行荧光标记，采用激光扫描设备自动计数。每个荧光点可直观地由通过计算机驱动的流动台连接到ChemScan上的落射荧光显微镜来检测，尤其对于生长缓慢的微生物，检测用时短使该方法明显优于传统平板计数法［22］。
　　6 全自动微生物分析系统(AMS)
　　AMS是一种由传统生化反应及微生物检测技术与现代计算机技术相结合，运用概率最大近似值模型法进行自动微生物检测的技术，可鉴定由环境、原料及产品中分离的微生物。AMS仅需4 h～18 h即可报告结果，以常规法鉴定细菌，只能得到是或不是某种菌，要想知到是哪种菌还要做大量、烦琐的生化试验，而AMS则可以直接报告是什么菌［23］。法国生物梅里埃集团公司出品的VitekAMS自动微生物检测系统属当今世界上最为先进、自动化程度最高的细菌鉴定仪器之一。Vitek对细菌的鉴定是以每种细菌的微量生化反应为基础，不同种类的Vitek试卡(检测卡)含有多种的生化反应孔，可达30种，可鉴定405种细菌［24］。用AMS明显缩短肠道菌生化鉴定的时间，如鉴定沙门菌属只需4 h，鉴定志贺氏菌属只需6 h，鉴定霍乱弧菌等致病性弧菌亦只需4 h～13 h［22］。总之，随着现代科技的发展，可以预料在不远的将来，传统的微生物检测技术将逐渐被各种新型简便的微生物快速诊断技术所取代。近年来兴起的基因探针技术及全自动微生物检测系统，将从根本上改变微生物的检测方法，具有非常广阔的应用前景。
【参考文献】
　　［1］ 唐灵，郭奕芳，吴翊，等.Petrifilm纸片法和国际法检测奶制品细菌总数和大肠菌群数的结果比较［J］.中国卫生检验杂志，2000,10(3):325327.
　　［2］ 吴清平，周艳红，蔡芷荷.卫生微生物特异性显色培养基的研究与应用［J］.中国卫生检验杂志，2005,15(1):124126.
　　［3］ Townsend D E．Comparison of the simplate coliform and escherichia coli test with pertrifilm，there tube MPN，and VRBA+MUG methods for enumeratlng coiiforms and Ecoli in food［J］．J Food Protection，1998，61(4)：444449．
　　［4］ 阚方琦，董非，李华，等．两种大肠菌群快检纸片的质量检测及应用效果比较［J］．预防医学文献信息，2003，9(2)：167168．
　　［5］ 汪琦．食品中霉菌检测两种方法的比较［J］．中国误诊学杂志，2004，4(4)：617618．
　　［6］ 刘秀锋，潘珍瑜，刘红，等．应用霉菌检测纸片快速检测食品霉菌的研究［J］．广西预防医学，2001，7(2)：99100．
　　［7］ 时炜．产单核细胞李氏菌在食品中的研究近况［J］．中国卫生检验杂志，2003，13(1)：122.
　　［8］ 陈灿卿．现代食品卫生学［M］．北京：人民卫生出版社，2002．
　　［9］ Turner KM．Efficacy of chromocult coliform agar for coliform and escherichia coil detection in foods［J］．J Food Port，2002，63(4)：539547.
　　［10］ Vialette M，Pinon A，Leporq B, et al．Metaanalysis of food safety information based on a combination of a relational database and a predictive modeling tool［J］．Risk Anal，2005，25(1)：7583．
　　［11］ 张凡非.副溶血性弧菌及其引起的食物中毒检验研究进展［J］.中国卫生监督杂志，2003，10：8.
　　［12］ 杜玉萍，陈清，王雅贤，等.胶体金免疫层析法检测金黄色葡萄球菌的初步研究［J］.热带医学杂志，2006，6：650.
　　［13］ 王中民，李君文，王新为，等．应用免疫层析法检测食品中的沙门菌［J］．中国卫生检验杂志，2003,12(5)：568.
　　［14］ 曹利蓉，张伟，晁蕊．ATP生物发光法在铁路站车食品器具卫生学检验中的应用［J］．铁道劳动安全卫生与环保，2004，31(2)：8687．
　　［15］ 舒柏华，孙丹陵，王胜利，等．肉类食品细菌污染生物发光快速分析技术研究［J］．中国公共卫生，2003，19(4)：483484．
　　［16］ 陈思强，钟伟强，曾振兴，等.自动酶联荧光免疫分析系统检测冻肉中沙门菌的评价［J］．中国国境卫生检疫杂志，2004，27(5)：309.
　　［17］ 孙素霞，陈思强，罗海吉.自动酶联荧光免役分析系统检测冻肉中李斯特氏菌［J］.南方医科大学学报，2006，26：1325.
　　［18］ Gunasekera TS,Veal DA，Attfield PV．Potential for broad applications of flow cytometry and fluorescence techniques in microbiological and somatic cell analyses of milk［J］．Int J Food Microbiol，2003，85(3)：269279．
　　［19］ Gunasekera TS,Attfield PV,Veal　flow cytometry method for rapid detection and enumeration of total bacteria in milk［J］．Appl Environ Microbiol，2000，66(3)：12281232．
　　［20］ Fuchs BM，Wallner G,Beisker W, et al．Flow cytometric analysis of the in situ accessibility of Escherichia coli 16S rRNA for fluorescently labeled oligonucleotide probes［J］．Appl Environ Microbiol，1998，64(12)：49734982．
　　［21］ Lisle JT,Hamilton MA，Willse AR，et al．Comparison of fluorescence microscopy and solidphase cytometry methods for counting bacteria in water［J］．Appl Environ Microbiol,2004,70(9)：53435348．
　　［22］ 王晓英．固相细胞计数法一种快速检测单细胞细菌的食品微生物新检测方法［J］．国外医学卫生学分册，2003，30(3)：183186．
　　［23］ 李丹红.全自动微生物分析系统在卫生防病检测鉴定中的应用［J］．口岸卫生控制，2000，5(3)：4243.
　　［24］ 杨毓环，陈伟伟．VITEK全自动微生物检测系统原理及其应用［J］．海峡预防医学杂志，2000，6(3)：3839．