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中药多糖的分子量及结构研究进展【摘要】 目前中药多糖药理作用研究比较活跃，而其分子量和分子量分布及化学结构确定成为进一步深入研究多糖特异性和构效关系以及药效机理的基础。该文归纳总结了多糖分子量和分子量分布及化学结构研究的方法。【关键词】 中药多糖; 分子量; 分子量分布; 化学结构; 生物活性Abstract:The study on pharmacological action of polysaccharide of traditional Chinese drug is more active at present, but the definition of molecular weight and molecular weight distribution and chemical constitution has become the foundation of better study on specificity and structure-function relationship and drug action mechanism of polysaccharide. The methods of study on molecular weight and molecular weight distribution and chemical constitutuion of polysaccharide were reviewed in this paper.Key words:Polysaccharide of traditional Chinese drug; Molecular weight; Molecular weight distribution; Chemical constitution; Biological activity 多糖通常是由几百甚至几千个单糖组成的高分子均聚物或共聚物，其能被水解为多个单糖。多糖存在于植物和动物之中，在高等植物和藻类中，它们是细胞壁或细胞内部的组分；在细菌和真菌中，它们可能既是细胞组分，又是新陈代谢的产物。多糖分子量很大，其性质也大大不同于单糖和低聚糖。现代研究发现茯苓、黄芪、猪苓、枸杞、柴胡、人参、香菇、云芝、银耳、灵芝、冬虫夏草等中药其生物活性成分之一是多糖，具有免疫调节、抗辐射、抗凝血、降血糖、降血脂等功效，而它们的生理活性与多糖分子量和分子量分布及化学结构有密切关系。1 中药多糖分子量和分子量分布研究 中药多糖是生物大分子，属高分子化合物，其分子量的测定方法有绝对法、当量法和相对法。表示其分子量大小的方式有重均分子量，数均分子量，粘均分子量和Z均分子量。多糖大多数情况下Mn M Mw Mz 。多糖的分子量分布是指多糖中各种不同的分子量组分在总量中所占的各自的分量，一般用分子量分布指数表示，即重均分子量与数均分子量的比值 ，比值愈大，说明分子量分布愈宽，当1时，是分子量均一体系。对于生物大分子多糖来说，其分子链的长短可以是不同的，在衡量其分子量时，往往是一个平均数。重均分子量是按分子重量统计平均的分子量，测定方法有光散射法、超速离心沉降速度法以及凝胶渗透色谱法等。数均分子量就是依据总体分子的的个数，求出分子量来的，数均分子量测定方法有端基分析法，气相渗透法，沸点升高冰点降低法，膜渗透压法，凝胶渗透色谱法等。中药多糖主要测数均分子量和重均分子量。目前常用体积排阻色谱法测定多糖分子量和分子量分布。2005年版中国药典部中收载了用高效凝胶渗透色谱法测定多糖分子量及分子量分布方法。1 凝胶渗透色谱法 凝胶渗透色谱法它是根据在凝胶柱上不同分子量的多糖与洗脱体积成一定关系的特性，先用各种已知分子量的多糖制成标准曲线，然后由样品的洗脱体积从曲线中求得分子量。用凝胶过滤法测分子量，每次缓冲液及流速均需一致，否则会产生较大的误差，凝胶柱多采用软质凝胶，常用的商品型号为交联葡聚糖sephadex，琼脂糖Sepharose，聚丙烯酰胺BIo-Gel P。A. E. A. Oliveira1等1用GPC法测定了刀豆属植物种子外皮多糖的重均分子量为8 830。孔庆胜等2采用凝胶过滤法测定南瓜多糖分子量，SephadexG-200层析柱，硫酸-苯酚法检测，测得南瓜多糖的平均分子量为16 000。陈洪亮等3用葡聚糖凝胶过滤法测定芦荟多糖分子量，所用凝胶为Sephadex-150，硫酸-苯酚法跟踪检测，结果分子量为45 400。盖英萍等4将桑叶多糖粗提取物通过SephadexG-200柱层析，检测得到3种多糖组分,后经SephadexG-75柱层析测定3种多糖组分的相对分子量为41 977，21 220，6 697。2 高效凝胶渗透色谱法高效凝胶渗透色谱法它是根据在凝胶柱上不同分子量的多糖与洗脱保留时间(tR)成一定关系的特性，先用各种已知分子量的多糖制成标准曲线，然后由样品的保留时间(tR)从曲线中求得分子量。高效凝胶渗透色谱法测定多糖分子量多采用示差折光检测器，示差折光检测器是一种通用型检测器，在液相色谱检测中多应用于对紫外-可见光没有吸收的化合物分析，只要被检测的化合物的折光指数与液相溶剂体系有差别即可被检测。高效凝胶渗透色谱中主要使用的是刚性凝胶柱，包括高交联度(40)苯乙烯-二乙烯基苯共聚物微球，常用的商品型号为TSK-Gel、Progel-TSKH-Type柱等；多孔球形硅胶，常用的商品型号为T5K- SW柱等；羟基化聚醚多孔微球，常用的商品型号为TSK -PW等。戴敬5采用色谱柱为TSK-G4000PWXL( mm cm),示差折光检测器，分析测定了13 批样品，得到四维灵芝液中多糖组分高效凝胶色谱图谱、多糖组分平均分子量。郭辉6采用色谱OHPakSB-805HQ(8 mm300 mm)，示差折光器检测器，测得红毛五加多糖各组分的重均分子量。姜素琴7采用色谱柱为TSK-GELG3000PWxl,测定云芝多糖的重均分子量、数均分子量及分子量分布指数。韩凤兰8应用SUGAR KS-804色谱柱，示差折光器检测器，测定宁夏黄芪多糖重均分子量、数均分子量及分子量分布指数。张红旭9用凝胶色谱分析柱为Ohpak SB-805HQC(300 mm8 mm), 示差折光器检测器，测定了香菇多糖的平均分子量。2 中药多糖的化学结构研究 多糖与蛋白质等生物大分子一样也有明确的三维空间结构，可以用一、二、三、四级结构来描述，其中二、三、四级结构属高级结构，多糖的一级结构是指多糖的单糖残基的组成、排列顺序、相邻单糖残基的连接方式、异头物的构型及糖链有无分支、分支的位置和长短等。多糖的二、三、四级结构是指多糖分子中主链的构象,侧链的空间排布，单糖残基空间相对定位等。由于单糖的种类比构成蛋白质的氨基酸种类多，连接的位点也多，故具有多分支结构的杂多糖结构的确定比蛋白质困难得多。多糖与蛋白质一样，其活性不但与立体结构有关，也存在活性中心，而且还与它所结合的蛋白质、色素、金属离子等有关。目前中药多糖化学结构测定方法很多，主要有酸完全水解、部分水解法，碱降解法、高碘酸氧化和Smith降解法、甲基化反应、酶降解、薄层色谱、高效液相色谱、红外光谱、核磁共振光谱、质谱、气质联用、X-射线衍射等。2.多糖一级结构测定常用光谱方法红外光谱法和紫外光谱法红外光谱在多糖结构分析上主要是识别糖的各种官能团并确定多糖中各种单糖的糖苷键及糖构型，以及不同糖的鉴别。刘宗林10经红外光谱分析推断西洋参的多糖是含有葡萄糖、半乳搪、木糖和阿拉伯糖的杂多糖。胡闻莉等11用红外光谱分析生脉散多糖纯品，结果表明其结构中存在型糖苷键(即-端基差向异构体)。紫外光谱在多糖结构分析上没有多大用处，但可利用在260,280 nm处有无吸收来判断多糖中是否有蛋白质，多肽及核酸，此外还可测定多糖的含量及糖醛酸含量。杨世平等12用紫外光谱法说明红枣多糖中蛋白质含量。核磁共振光谱法核磁共振光谱主要解决多糖结构中糖苷键的构型和重复结构中单糖的数目。1H核磁共振波谱主要解决多糖结构中糖苷键的构型，13CNMR化学位移范围宽广，信号清晰，在多糖结构分析中可确认各种碳核以及分辨分子的构型和构象。13CNMR可用来确定多糖残基中取代位置和分枝点13，而2D NMR对于多糖13CNMR谱全归属起着至关重要的作用14。白日霞等15利用C13核磁共振手段表征了mg级小皮伞多糖结构。李熙灿等16应用1H-NMR，13CNMR对黑海参中的多糖成分进行了结构鉴定。核磁共振技术对多糖结构的测定非常重要，如果再与糖组分分析17等技术相结合，将更有助于多糖结构的确定。质谱和气-质联用质谱在多糖的结构研究中是一种重要的手段，包括电子轰击质谱、化学电离质谱、快原子轰击质谱、电喷雾质谱、串联质谱等18。其中化学电离质谱能提供可靠的分子量，糖碎片的性质，还原糖和非还原端糖的情况等，气-质联用可大大简化糖的结构分析工作。白日霞19应用气相色谱-质谱法对甲基化多糖的测定方法及通过质谱解析对多糖的一级结构的推测原理进行了研究。张宏等20经气质联机(GC一MS)分析，初步确定了淫羊藿多糖结构糖苷的键型，并推测出其可能的结构。Ulrike经气质联机(GC一MS)分析snow mold蘑菇多糖，确定其为-(14)糖苷键葡聚糖21。多糖高级结构测定常用方法多糖高级结构分析中常应用X射线衍射法(XRD)、毛细管电泳法(CE)、核磁共振法(NMR),旋光度(ORD)和圆二色谱(CD)、快原子轰击质谱(FAB一MS)、气质联用(GC一MS)、原子力显微镜(AFM)等检测手段。X-射线衍射法主要用来测定多糖的晶体结构，王书军等22应用X-射线衍射法测定三种贝母多糖的晶体结构类型为B-型。圆二色谱常用来研究多糖的构型和构象，张丽萍等23利用圆二色谱测定了金顶侧耳多糖及其化学修饰产物水溶液的构象。原子力显微镜可以在空气和液体中对多糖分子的单分子和聚集体成像，得到单分子的直径、长度等量化信息和分子聚集体形貌特征24。 中药多糖的生物活性不仅与一级结构有关，而且与其高级结构关系密切。杨典洱等25研究发现脱乙酰壳多糖抑制真菌生长的能力与其分子量和化学结构紧密相关，脱乙酞壳多糖分子量越小，分子中的自由氨基越多，抑制真菌的活性越大。X-衍射分析表明，具有抗肿瘤活性的香菇多糖呈三股螺旋结构,当其失去三股螺旋构象，改变空间构型，其生物活性也随之消失26。研究表明中药多糖分子量、糖单元的组成、糖苷键的类型、主链的构型、支链的空间构型、取代基的种类及数量等与其生物活性密切相关。 伴随着中药现代化进程的加速，国内外关于中药多糖分子量、化学结构和药理作用的研究越来越多，但尚有许多不足之处。目前中药多糖结构研究大多仅限于一级结构，高级结构研究往往欠缺，而多糖的生物活性更多与其高级结构有关；中药多糖药代动力学研究尚处初级阶段，相关研究较少。因此通过多糖一级结构的确立，并结合新的分析方法和计算机辅助药物设计推断多糖的高级结构，可为中药多糖药代动力学研究打下坚实基础。随着现代分析技术手段不断引入，一定会提高中药多糖药物研究整体水平。【参考文献】 1A. 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