冠心丹参片有效部位三七总皂苷的含量测定.docx

冠心丹参片有效部位三七总皂苷的含量测定
【摘要】 目的紫外分光光度法测定冠心丹参制剂中三七总皂苷的含量。方法UV法，测定波长548 nm。结果线性范围 2～ mg；平均回收率:%，RSD为%。结论方法简便，灵敏度和准确度较高，结果满意。
【关键词】 冠心丹参片； 三七总皂苷； UV法
　　Abstract：ObjectiveTo establish the determination method of total saponins of Panax notoginseng in Guanxin Danshen tablet by UV. MethodsUV, the detection wavelength was at 548 nm. ResultsThe linear range was in the range of ～ The average recovery was　%, and RSD was %(n=6). ConclusionThe method is simple, highly accurate, and it can be used for quality control of Guanxin Danshen tablet.
　　Key words：Guanxin Danshen tablet; Total saponins of Panax notoginseng; Spectrophotometry

　　冠心丹参片由丹参、三七、降香油3味药组成，具活血化淤、理气止痛之功效，为《中国药典》77方剂。临床用于气滞血淤所致的胸闷、胸痹等，冠心病见上述证候者［1］。其中三七为该方的君药，具滋补强壮，活血化淤，消肿止痛等功效。现代研究表明，三七总皂苷是三七中的有效活性部位，具有强心、扩张冠状动脉、增加冠状血流量、抗动脉粥样硬化等药理作用［2］。

　　根据国家新药的有关规定，对冠心丹参片的二次开发，需对其有效部位建立测定方法。目前对冠心丹参片中有效部位三七总皂苷的分析尚未见报道。为综合评价冠心丹参片质量，本文首次采用紫外分光光度法测定了冠心丹参片中三七总皂苷的含量，优选了显色剂的比例并通过D101大孔树脂柱的分离去除丹参酚酸类成分的干扰，为更好地控制冠心丹参片提供质量评价手段。
　　1 仪器与试药

　　日本岛津UV-2550紫外分光光度计，UV-Probe工作站；岛津AUW220D型十万分之一分析天平；梅特勒AB104-N型万分之一分析天平；大孔吸附树脂D101型。

　　人参皂苷Rg1对照品由中国药品生物制品检定所提供；甲醇、乙醇、冰乙酸、香草醛等试剂均为分析纯；冠心丹参片。
　　2 方法与结果
　　测定方法
　　检测波长的选择对照品溶液与样品溶液于400～700 nm波长范围进行扫描，发现548 nm处有最大吸收。实验中选择测定波长为548 nm。
　　样品中三七总皂苷的测定取样品，研成细粉，取约70 mg,精密称定，置烧瓶中，加甲醇50 ml回流 h，放冷，滤过，用甲醇洗涤容器，滤液并洗涤液至100 ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，从中精密吸取溶液10 ml，蒸干，残渣加水溶解并转移至5 ml量瓶中，用水稀释至刻度，再从中精密吸取溶液1 ml，装入已处理好的D101大孔树脂柱，先用20%乙醇50ml洗脱，洗脱液弃去，继用70%乙醇洗脱，收集100 ml，蒸干，残渣用甲醇转移至2 ml量瓶中，并稀释至刻度，作为供试品溶液。精密吸取供试品溶液1 ml，置具塞试管中，80℃水浴挥干，冷却至室温，按“”项下方法显色，即得。
　　阴性干扰实验取处方中缺三七总皂苷的阴性样品，照供试品溶液制备项下操作，即得阴性对照供试液。对冠心丹参供试品溶液及缺三七阴性对照溶液分别进行紫外光谱扫描。在548 nm波长处进行扫描。紫外吸收光谱图。冠心丹参中缺三七的阴性对照样品无干扰。
　　图1 冠心丹参样品UV吸收光谱图
　　显色方法精密吸取对照品溶液/样品溶液 ml，置具塞试管中，置80℃水浴挥干，冷却至室温，加新制的5％香草醛冰乙酸溶液 ml，高氯酸 ml，60℃水浴加热15 min，立即用水冷却，加冰乙酸 ml，摇匀，即可。

　　显色剂比例的考察：显色剂的比例对测定结果有影响，为此考察显色剂的比例。显色剂以5％香草醛冰乙酸与高氯酸的比例为∶为宜。
　　图2 冠心丹参样品缺三七阴性对照UV吸收光谱图
　　表1 三七总皂苷显色剂比例考察
　　显色反应时间的考察：显色反应时间对测定结果有影响，为此考察显色反应时间。反应时间为15 min为宜。
　　表2 三七总皂苷显色时间的考察
　　样品的提取
　　三七总皂苷的提取经预实验表明，样品中的丹参酚酸类成分对三七总皂苷的测定有干扰，故设计过柱洗脱去除干扰。
　　乙醇洗脱浓度确定分别取丹参酚酸提取物、三七总皂苷提取物，精密称定，置150 ml回流瓶中，加甲醇50 ml回流1 h，放冷，滤过，用甲醇洗涤容器，滤液并洗涤液至100 ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，从中取10 ml，蒸干，残渣加水溶解并转移至5 ml量瓶中，用水稀释至刻度，再从中取1 ml，装入已处理好的D101大孔树脂柱，分别用20%乙醇30 ml，20%乙醇60 ml，20%乙醇80 ml，70%乙醇50 ml，70%乙醇100 ml洗脱，分别收集各洗脱液，蒸干，残渣用甲醇1 ml溶解，作为供试品溶液。按正文中所述“显色方法”显色，测定吸光度。测定结果见表3。20%乙醇溶液能将丹参总皂苷全部洗脱下来，而三七总皂苷无干扰，无吸收，70%乙醇溶液中，丹参总皂苷对三七总皂苷测定不造成干扰，此方法消除三七总皂苷的干扰。故实验中选择该方法对样品进行预处理。
　　表3 不同浓度乙醇洗脱分离三七总皂苷结果Ⅱ
　　蒸干对三七总皂苷的影响分别取三七总皂苷提取物溶液2 ml，分别直接在60℃水浴上蒸干、加入70%乙醇50 ml在60℃水浴上蒸干、加入70%乙醇50 ml在80℃水浴上蒸干、加入70%乙醇50ml在100℃水浴上蒸干，用甲醇定容至2ml,即得；再分别取上述溶液1 ml，80℃水浴上蒸干，按“”项下方法显色，测定吸光度。加入乙醇后，增长了蒸干时间，蒸干时间及蒸干的温度会对三七总皂苷的含量有影响，其含量下降在10%以内，影响不是很大。实验选择蒸干温度为80℃。
　　回流时间考察取同一批样品按样品的提取方法分别回流不同时间，并按含量测定方法测定。可见，回流 h的样品已提取完全，故实验采用回流时间采用 h。
　　表4 不同温度蒸干对三七总皂苷的影响结果
　　表5 冠心丹参三七总皂苷回流时间考察结果
　　提取溶媒的考察取同一批样品分别采用乙醇、甲醇、水照样品的提取方法提取，并按含量测定方法测定。可见，甲醇提取效果较佳。实验采用甲醇做提取溶媒。
　　表6 冠心丹参三七总皂苷超声时间考察结果
　　方法学考察
　　标准曲线的制备取人参皂苷Rg1对照品适量，精密称定，加甲醇制成每毫升含 mg的溶液，作为对照品溶液。精密吸取对照品溶液，，，，， ml，分别置具塞试管中，置80℃水浴挥干，冷却至室温，按“”项下显色，以相应的试剂为空白，分别在548 nm波长处测定吸光度。结果表明，人参皂苷Rg1 在 2～ mg范围内与吸收度呈良好线性关系，计算线性方程为：A = 8 C + ，r= 9。
　　精密度实验按样品测定项下制备供试品溶液1份，显色反应，连续测定6次，测得吸光度RSD为%。实验结果表明，仪器精密度良好。
　　重复性实验按样品的提取及含量测定方法对同一批样品重复测定5次，测定吸光度RSD为%。实验结果表明，重复性较好, 可能是由于样品提取操作繁琐的关系。
　　稳定性实验取同一样品溶液，显色后分别放置0，5，10，15，20，30 min后，在548 nm波长处分别测定吸收度，测定吸光度RSD为%。可知，测定的样品溶液在30 min内稳定。
　　表7 显色稳定性实验结果
　　回收率实验取已知含量的冠心丹参粉末6份，分别加入人参皂苷Rg1对照品，按含量测定项下方法测定回收率。可知，平均回收率为%，RSD为%，回收率良好。
　　3 讨论

　　《中国药典》中未见冠心丹参片的含量测定项，无法实现对冠心丹参片的有效质量控制；采用紫外分光光度法测定三七总皂苷，方法简便、快速、准确，能较好地对生产过程中的原药材及成品进行质量监控，提高了制剂标准的可行性及可靠性。

　　表8 加样回收实验结果
　　香草醛-高氯酸显色法和香草醛-硫酸显色剂可对皂苷类成分显色测定，但三七总皂苷对香草醛-硫酸显色剂显色不稳定，故选择香草醛-高氯酸显色法。丹参酚酸类成分和三七总皂苷类成分均对香草醛-高氯酸显色呈阳性反应。这可能是因为香草醛-高氯酸显色剂为通用性显色剂。故通过样品前处理将丹参酚酸类成分除去。

　　在显色剂的比例的选择中，考察了不同比例的5％香草醛冰乙酸与高氯酸对显色的影响。结果显示，随着5％香草醛冰乙酸量加大，高氯酸量减少，样品的最大吸收波长也随之增大，显色剂5％香草醛冰乙酸与高氯酸为∶以后，样品的最大吸收波长改变；5％香草醛冰乙酸与高氯酸的比例为∶时吸收度较高，且为三七总皂苷的经典显色比例［3］。故选用5％香草醛冰乙酸与高氯酸的比例为∶，确保了在对照品和样品在相同最大波长处显色，测定波长及吸收系数的选择可行、可靠。

　　样品中的丹参酚酸类成分对三七总皂苷的测定有干扰，故通过D101大孔树脂柱的分离，将丹参酚酸类成分与三七总皂苷类成分分开。

　　分离方法首先采用水，30%乙醇，50%乙醇，70%乙醇依次洗脱；但结果显示，该方法未将丹参酚酸及三七总皂苷分离，故设计新洗脱梯度来进行分离：用水，20%乙醇，70%乙醇洗脱。20%乙醇溶液能将丹参酚酸全部洗脱下来，70%乙醇洗脱液中，丹参酚酸对三七总皂苷测定不造成干扰，表明此方法可行，能将丹参酚酸与三七总皂苷分离。

　　本实验通过线性关系、精密度、稳定性、重复性和加样回收率实验及样品测定结果考察，表明本质量标准所制定的样品前处理方法和以香草醛-高氯酸显色的含量测定方法，可以有效地去除杂质的干扰，检测数据真实、可靠，可作为该产品质量的检测方法。
【参考文献】
［1］ 汪艺云，傅 兰，何国兴.冠心丹参滴丸治疗冠心病心绞痛76例［J］.中国护理杂志，2006，3：54.
　　［2］ 甘 雨，徐惠波，孙晓波.三七总皂苷的药理作用研究进展［J］.时珍国医国药，2007，l8：1251.
　　［3］ 江 林，顾琼珠，何廷能，等.树脂吸附分离-比色法测定三七中总甙含量［J］.云南中医学院学报，1995，18：11.