广西一点红总生物碱的提取和抗菌活性研究.docx

广西一点红总生物碱的提取和抗菌活性研究【摘要】 目的考察广西一点红总生物碱的分离提纯及其抗菌活性。方法通过95乙醇回流提取一点红药材中的生物碱类物质，利用酸水提取法及有机溶剂萃取对其进行分离纯化，同时用化学检识法与薄层色谱法进行定性鉴别。采用滤纸片法研究一点红生物碱类物质的抗菌活性。结果一点红生物碱浓度在600800 mg/ml时对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌及枯草杆菌中度敏感，随着药物(生物碱)浓度的增大，抗菌作用越明显。结论说明一点红生物碱类物质对供试菌有一定的抑菌活性。【关键词】 一点红 总生物碱 提取分离 抗菌活性Abstract：ObjectiveTo investigate the extraction and separation methods and antibacterial activities of the alkaloids in Emilia sonchifolia fromalkaloids in Emilia sonchifolia were reflux extracted by 95% alcohol, and separated by acid water extraction and organic solvent extraction method, at the same time qualitative identification was performed by the chemical methods and the thin layer chromatography methods. To study the antibacterial activities of the alkaloids in Emilia sonchifolia by filter paper method. Results The result showed it was medium sensitive to Escherichia coli, Bacillus subtilis and Staphylococus aureus when the concentrations of the alkaloids were in the range of 600800 mg/ml. The antibacterial function was more remarkable with the medicine concentrations increased. ConclusionThe alkaloids of Emilia sonchifolia has certain antibacterial activities against the selected microbes.Key words：Emilia sonchifolia; Total alkaloids; Extraction-Separation; Antibacterial activity 一点红Emilia sonchifolia (Linn.) DC属菊科植物一点红的干燥全草，主产于广东、广西、福建、贵州、江西，具有清热解毒、活血散瘀的功效，用于治疗急性扁桃体炎、肺炎、急性阑尾炎、传染性肝炎、痢疾、尿路感染等疾病1。一点红是妇科临床常用药广西特产中成药花红片的主要原料药2，其主要含有黄酮类3，生物碱类1，甾醇类4等化学成分。据文献报道，一点红提取物有一定的抗氧化和抗炎作用5，6，并且对金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌和痢疾杆菌有一定抑制作用1。国内外仅对一点红的种植和临床应用方面有少量研究，对活性成分抗菌性能未见有相关报道，而生物碱常常是很多中草药的有效成分，具有抗炎抗菌的药理作用。故实验分离提纯一点红总生物碱类物质，进行体外抗菌活性研究，为寻找一点红抗菌的活性成分提供一定参考，为有效利用广西草药资源提供依据。 1 材料与方法1 材料中药一点红干燥全草(由广西花红药业提供)，阳性对照硫酸链霉素粉针剂，甲醇、乙醇、丙酮、氯仿、醋酸乙酯、环己烷等试剂均为分析纯。供试菌种：大肠杆菌Escherichia coli，枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis，金黄色葡萄球菌Staphylococus aureus，以上菌种由广西工学院生物与化学工程系微生物实验室提供。培养基：营养琼脂粉，营养肉汤。2 一点红生物碱的提取分离称取一点红药粉约100 g，加95%乙醇1 000 ml水浴回流提取2 h，减压抽滤得到提取液，药渣加入新溶剂反复提取3次，合并提取液，用旋转蒸发仪回收乙醇，挥干溶剂得到生物碱粗提物浸膏。浸膏加1%盐酸溶解，减压过滤，滤液用氯仿萃取至氯仿层无色，弃去氯仿层，水层用10%氨水调节pH值为911，用氯仿萃取3次，合并氯仿层(加入少量K2CO3，脱水)，回收氯仿得到总生物碱提取物，干燥称重，计算提取率，产品于干燥器中保存。在提取与纯化过程中适时用生物碱检测试剂同时追踪检识生物碱。3 生物碱的鉴别取出待测液各1 ml置于试管中分别做生物碱、黄酮及甾醇类物质的化学检识试验7。将所提得样品溶解于无水乙醇中，点样于硅胶G薄层色谱板上，分别采用环己烷甲醇；醋酸乙酯甲醇氨水及丙酮三个极性大小不同的展开系统对一点红生物碱提取物进行薄层色谱分离，用碘化铋钾试剂显色，电吹风吹干，观察现象。4 体外抑菌实验 培养基的制备营养琼脂：称取33 g营养琼脂粉，加1 000 ml蒸馏水溶解，分装，包扎，于121，条件下，灭菌20 min。生理盐水:称取 g氯化钠，加100 ml蒸馏水溶解，于121, MPa条件下，灭菌20 min。 菌悬液的制备取原菌种在无菌室的净化工作台上用接种环对每种菌轻刮取一环，划线接种于营养琼脂培养基上，置于37恒温培养箱中培养24 h，以平板培养计数法测定其生长浊度，然后将菌液稀释至106108个菌/ml备用8。 测试溶液的配制用10的吐温溶液将提纯的生物碱样品配制为100，200，400，600，800 mg/ml的溶液作为待测液，同时用10吐温配制浓度为 mg/ml的硫酸链霉素溶液作为阳性对照液，用孔径为 m的微孔滤膜过滤器滤过除菌。抑菌实验抗菌实验采用滤纸片法9。选择吸水性强的滤纸，用打孔器打成若干直径为6 mm的滤纸片，经干热灭菌后浸在测试溶液中，备用。在培养皿中倒入已灭菌的培养基，冷凝后，将配置好的3种细菌的菌悬液用无菌移液枪分别吸取 ml均匀涂布在对应的培养皿上，于37培养箱中正面培养1 h。用无菌镊子分别夹取含有 mg/ml硫酸链霉素溶液的滤纸片，10%吐温溶液的滤纸片、含待测液及空白的滤纸片置于同一培养皿中，每种浓度的药物平行做两皿，1 h后，把培养皿倒置，于37培养24h，取出，测量抑菌圈直径的大小。2 结果一点红总生物碱提取率及鉴别结果95%乙醇回流提取的平均提取率为。同法提取的4份提取物用3种典型的生物碱试剂进行化学检识均呈明显的生物碱阳性反应，同时进行黄酮，甾醇类物质的检识均呈阴性反应。通过采用3个不同极性展开系统的薄层色谱鉴别，可以看出1，3号样品有明显的拖尾现象，2，4号样品为清晰的单一斑点，选用分离纯度较高的样品进行抗菌试验。结果见图1。一点红生物碱的抑菌实验结果药敏试验判断标准以抑菌圈大小为依据，抑菌圈大于20 mm为高度敏感，1020 mm为中度敏感，10 mm以下为低度敏感。一点红生物碱对3种菌有一定的抑制作用，浓度在400800 mg/ml之间时金黄色葡萄球菌及大肠杆菌的抑菌圈介于1020 mm之间，属于中度敏感。生物碱浓度在600800 mg/ml之间对枯草杆菌中度敏感。结果显示一点红生物碱类物质对3种细菌的抑菌强度没有太大差异。3 讨论生物碱的提取鉴定曾试用丙酮作为回流提取剂，平均提取率为，低于乙醇。由于氯仿、丙酮、乙醚和甲醇具有一定毒性，乙醇毒性较小且提取率较高，故实验选用95%乙醇对一点红进行生物碱提取。回收溶剂后得到生物碱粗品，利用生物碱在酸性条件下成盐溶于酸水的特性，加入氯仿去除脂溶性杂质，再将酸水液碱化使生物碱游离，利用游离生物碱一般溶于脂溶性有机溶剂的性质，用氯仿将其萃取出来，去除水溶性杂质。实验中分离提纯得到的几个样品经化学检识和薄层色谱鉴别后确定为生物碱类物质，由于一点红主要含有黄酮、生物碱、甾醇等成分，同时检识样品中的黄酮、甾醇成分均呈阴性结果。2号和4号样品在3个不同极性的展开系统下均为单一清晰的薄层色谱斑点，说明分离得到的总生物碱较纯，用此法分离提纯生物碱类成分较好。体外抗菌实验实验中排除了抗菌实验的相应干扰。不加菌液的阴性对照培养皿无菌落生长，说明全过程无菌技术的可靠性较强；在无抗菌药物的培养基上实验菌生长良好，说明所配制培养基无质量问题；实验用硫酸链霉素溶液作为阳性对照，该已知抗菌药物对实验菌株出现了预期的抗菌效果；无菌水的空白对照无抑菌圈；10的吐温溶液的溶剂对照无抑菌圈，说明溶解样品的溶剂无抗菌作用；同时测定生物碱待测液的pH值为78之间，排除了药物本身pH值对实验菌生长的干扰。活性成分研究实验结果表明一点红生物碱对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌及枯草杆菌有一定的抑制作用。目前国内外有少量有关一点红提取物抗菌性能的研究5，6，但是关于一点红的药效活性成分与疗效关系方面的研究仍然十分缺乏，一点红的具体化学成分仍未明确，其抗炎抗菌的有效成分也尚未确定，故所含的其它成分是否也有抑菌作用尚待进一步的研究。【参考文献】 1广西壮族自治区革命委员会卫生局.广西本草选编(下册)M.南宁：广西人民出版社，1974：940. 2韦飞燕.花红片薄层色谱鉴别研究J.广西中医学院学报，2000，17:65.3李秀信，王荣花，杨秀萍.一点红黄酮成分的分析及含量测定J.西北植物学报，2003，23(4):671.4高建军，程东亮.一点红化学成分的研究J.中国中药杂志,1993,18(2) :102.5 Shylesh, and anti-inflammatory activity of Emilia sonchifoliaJ.Fitoterapia,1999,70:275.6,Muko, preliminary study on the anti-inflamimatory properties of Emilia sonchifolia leaf extractsJ.Fitoterapia,2000,71：65.7肖崇厚.中药化学M.上海：上海科学技术出版社,1997:93.8周德庆.微生物学实验手册M.上海：上海科学技术出版社，1986，12：65.9郑钧镛，王光宝.药品微生物学及检验技术M.北京：人民卫生出版社，1989：89.