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中草药清除超氧自由基的极谱法研究
【摘要】　比较了几种自氧化体系产生超氧自由基的效果，选定邻苯三酚自氧化体系产生超氧自由基，用单扫描示波极谱法扫描，研究8种中草药对超氧自由基的清除作用。
【关键词】　中草药; 单扫描示波极谱法; 超氧自由基; 清除作用
　　Abstract:The effects of producing the superoxide free radicals by the several of oxidation system have been studied. The pyrogallol acid was used by single-sweep oscillopolarography to determine the scavenging superoxide free radical activity against of ght Chinese drugs.
　　Key words:Chinese drugs; Single sweep oscillopolarography; Superoxide free radical; Scavenging effect
　　自由基在人体内能引起机体氧化，损害细胞，导致机体衰老和各种疾病。自由基是一种外层轨道含有未配对 电子 的特殊状态分子或原子团，其中超氧自由基(O-2·)与人体最为密切。一些物质，如超氧化物歧化酶(SOD)、维生素C、维生素E、胡萝卜素等能清除人体的自由基。但体内的O-2·浓度随年龄的增长而增加，自由基清除能力则随年龄的增加而减少，有时不能提供足够的量来消除O-2·。因此研究和寻找外源性O-2·清除剂在人体保健、治病方面具有重要意义，从天然动植物，尤其是从具有悠久 历史 的中草药中寻找高效的超氧自由基清除剂，已引起了国内外学者的极大兴趣[1～5]。
　　分子氧在单电子还原时有超氧阴离子自由基O-2·中间体生成。O-2·既可作为电子的给予体，又可接受电子，在体内可通过电子转移反应衍生出其它活性氧。从研究的角度来说，获得O-2·大体有多种方法[6,7]。本文采用化学法产生O-2·，且对比了邻苯三酚[8,9]、亚甲基兰、二甲基亚砜生成O-2·的效率。
　　中草药含有多种能够清除自由基的化合物，其抗氧化成分可归纳为6大类：黄酮类、苯酚类、皂苷类、鞣质类、生物碱类和其他类[9～11]。近年来对中药抗自由基作用的研究多采用电子自旋共振、化学发生等方法，用电化学方法研究中药对超氧自由基的清除作用报道较少。但是后者也有其优势所在，所用仪器简单，操作简单，成本低，相对于化学发光法，不受到溶液颜色和惰性杂质的影响。本文利用电化学分析方法，研究了几种中草药对超氧自由基的清除作用，对推动进一步研究中草药在延缓机体衰老方面将发挥有利作用。
　　1 仪器和试剂
　　JP303型极谱分析仪(成都分析仪器厂);滴汞电极、饱和甘汞电极和铂电极组成的三电极系统;电子天平(AL104，梅特勒-托利多仪器有限公司);PHS-3C型酸度计(萧山市分析仪器厂)。
　　邻苯三酚(宜兴兴隆化工有限公司)，三羟甲基氨基甲烷(上海山浦化工有限公司)。
　　其余试剂均为国产分析纯，实验用水均为二次蒸馏水。
　　红花、何首乌、当归、苡米、白芷、丹参、黄芩、茯苓8种中草药购于药材公司，经检验均为正品。
　　2 方法与结果
　　超氧自由基化学发生体系的比较
　　方法邻苯三酚、亚甲基兰和二甲基亚砜均能发生自氧化反应产生超氧自由基阴离子，研究了三者产生超氧自由基阴离子的效率。
　　分别制取 mmol/L邻苯三酚溶液、1 mg/ml亚甲基兰溶液、 mg/ml二甲基亚砜溶液、 mol/L三羟甲基氨基甲烷溶液、pH=的NH3-NH4Cl缓冲溶液。
　　在 ml的 mol/L三羟甲基氨基甲烷溶液中加入 ml的 mol/L盐酸，稀释至100 ml，得到pH=的缓冲溶液。取 ml为底液，加入 ml的 mmol/L邻苯三酚溶液，再加 ml蒸馏水。采用线性扫描法记录二阶导数极谱波。
　　移取 ml pH=的NH3-NH4Cl缓冲溶液，加入 ml的 mg/ml二甲基亚砜溶液，再加 ml蒸馏水。采用线性扫描法记录二阶导数极谱波。
　　移取 ml pH=的NH3-NH4Cl缓冲溶液加入 ml的1 mg/ml亚甲基兰溶液，再加 ml蒸馏水。采用线性扫描法记录二阶导数极谱波。
　　结果讨论在pH=的HC1-Tris缓冲溶液中，邻苯三酚可发生自氧化反应产生超氧自由基阴离子，在- V处有一还原峰，此峰为检测对象，它先逐渐增高，到一定时间后又缓慢降低。峰高随时间的变化如所示。此峰在 min处最高，且变化较小，记录该峰在此时间点的峰高值作为空白对照读数。
　　在pH=的NH3-NH4Cl缓冲溶液中，二甲基亚砜和亚甲基兰均可发生自氧化反应产生超氧自由基阴离子，两者分别在- V、- V处有一还原峰，峰形均它先逐渐增高，到一定时间后又缓慢降低。峰高随时间的变化如图1所示。二甲基亚砜在 min处最高，且变化较小;亚甲基兰在 min处最高，且变化较小。分别取此峰高最大处的时间点作为分析点，记录峰高值作为空白对照读数。
　　图1 邻苯三酚、二甲基亚砜、亚甲基兰的峰电流随时间的关系
　　图1中3条曲线从上到下分别为邻苯三酚、二甲基亚砜、亚甲基兰的峰电流和时间的关系，邻苯三酚、二甲基亚砜、亚甲基兰3种试剂在碱性条件下，在- V左右均能产生超氧自由基，但邻苯三酚产生超氧自由基的效果比另外两种试剂的效果要好的多。因此在测定8种中草药清除超氧自由基作用的实验中，产生超氧自由基采用邻苯三酚自氧化法。
　　当归等4种中草药清除超氧自由基的研究
　　实验方法将中药粉碎，每种各称取5 g，以1∶1的甲醇-水为溶剂，在回流装置中回流3 h左右，将溶液过滤，滤渣再回流2次，几次回流滤液合并、定容，得8种中草药提取液，储于冰箱备用。以每毫升提取液相当于每毫克生药量为浓度单位，将8种中草药提取液各自稀释为，，，， mg/ml 5种浓度的溶液。
　　在 ml　mol/L的三羟甲基氨基甲烷溶液中加入 ml　mol/L的盐酸，稀释至100 ml，得到pH=的缓冲溶液。取 ml为底液，加入 ml　mmol/L邻苯三酚溶液。
　　于相同的HC1-Tris底液中分别加入8种中草药不同浓度的溶液，，，， ml，观察其对极谱峰电流的抑制作用，采用线性扫描法记录二阶导数极谱波，扫描电位范围为-～ V。在=- V处，读取 min时的峰高，平行测定3次取平均值。
　　根据公式求抑制百分率：I(%)=(i0-i)/i×100%
　　I0为空白对照峰电流读数，i为样品峰电流读数。求出8种中草药不同浓度溶液对超氧自由基的抑制率，以抑制率为50%时的相应浓度(IC50)来表示各种中药的清除超氧自由基的能力。
　　结果讨论酸度对邻苯三酚氧化能力的影响：在酸性条件下，邻苯三酚是很稳定的，而当pH大于以后，邻苯三酚能迅速氧化，随着pH的增大，其氧化速度加快。见2。
　　图2 邻苯三酚自氧化速度随酸度的变化关系
　　中草药对超氧自由基的清除作用：酸等蒽醌类化合物都具有对超氧自由基的清除作用。主要是通过他们含有的酚羟基类基团与超氧阴离子自由基发生了单 电子 转移的氧化还原反应所致，有氧化、还原、歧化3种不同的途径。
　　另外约70%以上的中药中含有鞣质类化合物，尤其在裸子植物及双子叶植物的皮、叶、根、果实等部位。鞣质类化合物为强还原剂，尤其在碱性条件下，它可使KMnO4褪色，因此它也可以与超氧自由基发生反应。常见的鞣质类化合物有没食子酸、儿茶素等。
　　在pH=的缓冲溶液中，用邻苯三酚产生超氧自由基，分别加入8种中药浓度各为，，，， mg/ml的溶液，极谱扫描，记录其二阶导数峰电流， 计算 出对应的抑制百分率。以抑制百分率为纵坐标，中药的相对浓度为横坐标作图3。
　　由图3可以看出8种中草药的抑制率和浓度之间在一定浓度范围内呈线性关系，图3中8条曲线从上到下分别黄芩、红花、丹参、当归、白芷、苡米、何首乌、茯苓。表1的抑制能力排序也说明了这一点。表1 不同中药对超氧自由基阴离子的清除作用
　　3 讨论
　　本实验利用邻苯三酚自氧化过程产生超氧自由基，用单扫描示波极谱法观测了红花、苡米等中草药对超氧自由基的抑制作用，从而证实了电化学方法是一种检测超氧自由基的有效方法，方法简便易行。结果表明，各中药在较高浓度时均有良好的清除超氧阴离子自由基的能力且清除率都与提取物的浓度成正比。本文的研究对于进一步开发利用中草药和拓展电化学分析方法的作出了有益的探索。
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