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复方红景天口服液的指纹图谱测定方法研究
【摘要】 　　目的研究复方红景天口服液的HPLC指纹图谱的测定方法。方法采用高效液相色谱法，色谱柱：Diamosil C18 (200 mm× mm, 5 μm)，流动相：乙腈-%磷酸水溶液(梯度洗脱)，柱温30℃ ，检测波长：223 nm，分析时间55 min，流速1 ml·min-1。结果标示出复方红景天口服液23个共有峰。结论该法测定的HPLC指纹图谱为复方红景天口服液的质量控制提供了更全面的信息。
【关键词】 复方红景天口服液； 高效液相色谱； 指纹图谱； 质量标准
　　Abstract：ObjectiveTo establish an RP-HPLC method for determination of the fingerprint of Compound Oral Liquid of Rhodiola. MethodsChromatographic conditions included a column of Diamosil C18 (200 mm× mm, 5 μm) and the mobile phase consisted of a mixture of acetonitrile-water(gradient elution)，the detection wavelength at 223 nm,and the mobile phase flow rate was　ml·min-1. Results23 peaks existed in the HPLC fingerprint of Compound Oral Liquid of　method can provide more information for the quality control of Compound Oral Liquid of Rhodiola.
　　Key words：Compound Oral Liquid of Rhodiola； HPLC； Fingerprint； Quality control
复方红景天口服液是沈阳药科大学研制的由红景天、刺五加、枸杞等补益中药经提取、精制而成的口服液制剂。主要用于高原反应所引起头晕，头痛，心悸，气喘，乏力，缺氧引起的红细胞增多症。现代药理学研究表明，红景天具有增强机体免疫功能、抗疲劳、抗衰老及增强脑力、体力机能等作用［1～6］。本品处方中主要含有红景天、刺五加、枸杞3味药材，目前采用的质量标准中除有TLC鉴别外，只有一个HPLC的含量测定项目，用于测定制剂中红景天苷的含量。近年来，国内众多研究工作者尝试采用各种方法致力于中药质量控制方法研究，并提出许多非常有意义的见解和观点。为了全面而有效的控制复方红景天口服液的内在质量，本研究应用RP-HPLC方法，建立了复方红景天口服液的HPLC指纹图谱分析方法，为其质量控制提供了更全面的信息。
　　1 器材1 仪器
　　HITACHI L-7100型输液泵，HITACHI L-7420型紫外检测器， AnaStar 色谱工作站；色谱柱Diamosil C18 (200 mm× mm, 5 μm)，。2 试药红景天、枸杞子、刺五加购于辽宁省药材公司，经沈阳药科大学中药学院孙启时教授鉴定均为正品药材；复方红景天口服液各批号成品，由沈阳药科大学药用植物实验室提供；红景天苷对照品。甲醇；乙腈；纯净水；其它试剂均为分析纯。3 条件考察 流动相的选择 实验过程中选择了3种流动相系统：①A乙腈，B水；②A甲醇-乙腈 (1∶1)， B %磷酸水溶液；③A乙腈， B %磷酸水溶液。流动相以③A乙腈， B %磷酸水溶液系统效果最佳。 检测波长的选择根据红景天组成，实验过程中共选择了223，254，278 nm 3种波长进行检测。在223 nm波长下出现的色谱峰数目比较理想，各色谱峰相互之间分离度和稳定性较好。 样品溶液制备方法的选择①量取10 ml口服液，用正丁醇萃取3次10 ml/次，合并正丁醇层，回收正丁醇，残渣溶于适量甲醇并定容于10 ml量瓶中。
②量取10 ml口服液，用氯仿萃取3次，10 ml/次，弃去氯仿层，再用正丁醇萃取3次10 ml/次，合并正丁醇层，回收正丁醇，残渣溶于适量甲醇并定容于10 ml量瓶中。
③量取10 ml口服液，上D101大孔树脂柱，用400 ml蒸馏水洗脱，弃取。再用400 ml 70%的乙醇洗脱，收集洗脱液，回收乙醇，残渣溶于适量甲醇并定容于10 ml量瓶中。
结果以方法③制备供试品，可以使图谱基线较平稳，并可以使各峰得到较好的分离。
　　2 方法
　　色谱条件及色谱适用性实验色谱柱：Diamosil C18 (200 mm× mm, 5 μm)，流动相：乙腈-%磷酸水溶液(梯度洗脱)；柱温30℃ ，检测波长223 nm，分析时间55 min，流速1 ml·min-1。进样量：供试品溶液与对照品溶液各10 μl；理论塔板数以红景天苷峰计不少于15 000。
　　对照品溶液的制备
　　精密称取红景天苷对照品5 mg，精密称定，置于25 ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
　　供试品溶液的制备量取10 ml口服液，上D101大孔树脂柱，用400 ml蒸馏水洗脱，弃取。再用400 ml 70%的乙醇洗脱，收集洗脱液，回收乙醇，残渣溶于适量甲醇并定容于10 ml量瓶中，用微孔滤膜过滤，取续滤液即得。
　　方法学考察
　　精密度实验取同一复方红景天口服液供试品溶液，连续进样5次，10 μl/次，检测指纹图谱，测定主要共有峰的相对保留时间和相对峰面积，结果主要共有峰1～23号峰相对保留时间的RSD为%～%，相对峰面积的RSD为%～%，结果表明，仪器精密度好。
　　稳定性实验
　　取同一复方红景天口服液供试品溶液，分别在0，2，4，8，16 h进样，10μl/次，检测指纹图谱，测定主要共有峰的相对保留时间和相对峰面积，结果主要共有峰1～23号峰相对保留时间的RSD为%～%，相对峰面积的RSD为%～%，结果表明供试品溶液常温下0～16 h之间可保持稳定。
　　重复性实验
　　取同一批号的复方红景天口服液样品5份，分别按供试品溶液制备方法制备供试品溶液，并分别测定其色谱图，结果其相对保留时间稳定，主要共有峰1～23号峰相对保留时间的RSD(%)为%～% ，相对峰面积的RSD为%～%，符合指纹图谱要求。说明本方法重复性较好。
　　共有指纹峰的标定取10批复方红景天口服液样品，分别按供试品的制备方法处理，在上述色谱条件下，测定其色谱图。其中3号峰保留时间与红景天苷峰保留时间一致，作为参照峰。综合10批样品的色谱图，发现其中有23个峰为10批样品所共有的，因此确定为共有指纹峰。根据10批样品的平均值，以保留时间与红景天苷峰一致的3号峰为参照峰，标定了23个共有指纹峰及其相对保留时间 1(～)，2(～)，3()，4(～)，5(～)，6(～)，7(～)，8(～)，9(～)，10(～)，11(～)，12(～)，13(～)，14(～)，15(～)，16(～)，17(～)，18(～)，19(～)，20(～)，21(～)，22(～)，23(～)。各共有指纹峰相对保留时间RSD在%～%之间。见图1。
　　拆方分析在同样色谱条件下，分别测定红景天苷对照品，方中单味药红景天样品、单味药刺五加样品、单味药枸杞子样品，并和复方红景天口服液的指纹图谱色谱峰一一对照，可知共有峰中1，2，3，6，8号峰来源于处方中红景天；9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，21，22号峰来源于方中刺五加，20，23号峰为红景天与刺五加共有；3号峰为红景天苷。4，5号峰暂无归属，估计为辅料峰。见图2。
　　相似度评价分别采用夹角余弦法和相关系数法计算样品的相似度，10批口服液样品的相似度计算结果见表1。表1 10批样品指纹图谱相的相似度
　　3 讨论
本品为复方制剂，所含成分相当复杂，而且含糖量极高，故需将样品先进行纯化、浓缩等处理，方能进行HPLC测定。本实验中供试品溶液的制备方法是根据该制剂主要由红景天、枸杞子、刺五加为原料制成，主要有效成分为酚苷类、甾体苷、香豆精苷、木质素苷成分而拟订的。
在实验中发现，10批样品的HPLC指纹图谱中，各批号样品间共有指纹峰的相对保留时间比较吻合，但部分批号个别峰相对峰面积波动较大，认为可能是生产所用原料各批次间存在差异所致。
实验研究结果表明，在药材产地，采收，加工方法等相对固定的前提条件下，利用HPLC色谱指纹图谱来控制中成药复方红景天口服液的质量优劣是切实可行的，它比现行质量标准要更全面、客观，该法为复方红景天口服液的质量控制提供了更全面的信息。
【参考文献】
　　［1］王淑兰，王宜，李淑连，等.红景天素抗老化作用的实验研究［J］.白求恩医科大学学报，1991,17(16):542.
　　［2］姜文华，孟晓婷，郝利铭，等.红景天素抗老化和抗痴呆效应的实验研究［J］.白求恩医科大学学报，2001,27(2):127.
　　［3］赵永焕，刘成海，武延华.红景天的研究与应用［J］.中国林副特产，1998,3：44.
　　［4］Darbinyan V, Kteyan A, Panossian A, et al. Rhodiola rosea in stress induced fatigue - A double blind cross-over study of a standardized extract SHR-5 with a repeated low-dose regimen on the mental performance of healthy physicians during night duty［J］. Phytomedicine，2000,7(5):365.
　　［5］Spasov A, Wikman G, Mandrikov V, et al. A double-blind, placebo-controlled pilot study of the stimulating and adaptogenic effect of Rhodiola rosea SHR-5 extract on the fatigue of students caused by stress during an examination period with a repeated low-dose regimen［J］.Phytomedicine，2000,7(2):85.
　　［6］李英信,朴 花,李红花，等.高山红景天提取物对小鼠脾淋巴细胞转化反应的影响［J］. 延边大学医学学报，1998，21(2)：96.