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新的肾上腺脑白质营养不良基因突变1例的鉴定
【摘要】 目的： 对1例肾上腺脑白质营养不良患者及其家系成员的ALD基因的突变类型进行鉴定. 方法： 以外周血RNA为模板，采用长链RTPCR技术，分4个片段扩增ALD基因mRNA的编码序列，对4个PCR产物进行直接测序，筛查整个基因编码区. 通过限制性内切酶酶切分析患者及其家系成员基因组ALD基因片段，以进一步确证所发现的基因突变. 结果： 位于患者ALD基因第6外显子的第508位密码子存在一个新的错义突变CCC→CTC (P508L)，患者母亲为突变携带者，患者父亲和妹妹不存在此突变. 结论： 发现中国ALD患者一个新的ALD基因突变，即P508L突变.
　　【关键词】 肾上腺白质营养不良；ALD基因；突变，误义；ALD蛋白
　　0引言
　　肾上腺脑白质营养不良(ALD, adrenoleukodystrophy)是最常见的一种遗传性中枢神经髓鞘合成病变［1］. 致病基因位于X染色体，编码一个有745个氨基酸残基的过氧化物酶体膜蛋白，即ALD蛋白. 我们对1例肾上腺脑白质营养不良患儿及其家庭成员的ALD基因突变进行了分析.
　　1对象和方法
　　1．1对象男，7岁，汉族，福建省周宁县人，因进行性视力下降、步态不稳1 a余入院. 检查：神志清楚，对答尚切题，言语含糊，不配合，双眼视力光感，吞咽困难，饮水呛咳. 心、肺、肝、脾未见异常. 脑电图中度异常，体感诱发电位异常. 颅脑MRI示枕顶部蝶形长T1和长T2信号的病灶. 气相色谱查患者血浆24碳饱和脂肪酸浓度： mg・L-1, 22碳饱和脂肪酸浓度： mg・L-1，两个浓度比等于(正常范围左右). 患者非近亲婚配所生，另有一妹妹，无家族史. 临床诊断：肾上腺脑白质营养不良.
　　1．2方法ALD基因的mRNA长 kb，其中编码区为2238 bp. 本研究合成4对引物［2］，即：PIF和RT1, PⅡF和RT2, PⅢF和RT3, PⅣF和RT4，分4段对ALD基因编码区进行扩增，预期大小分别是722, 700, 723和646 bp，其中ALD1的3′端和ALD2的5′端部分重叠，ALD2的3′端和ALD3的5′端部分重叠，ALD3的3′端和ALD4的5′端部分重叠. 若以PIF和RT4为引物对扩增ALD基因cDNA， 预期片段大小是2440 bp. 引物委托上海生工生物工程公司合成.
　　1．2．1长链RTPCR及测序从患者取新鲜抗凝血~3 mL，按Qiagen产品说明书提取总RNA. 长链RTPCR按TaKaRa试剂盒说明书进行. 先进行反转录，然后在PE2400型热循环仪上进行PCR反应：94℃变性2 min后，按94℃ 30 s, 60℃ 30 s, 72℃ 2 min循环30次. 最后一个循环结束后继续在72℃延伸8 min. 将上述PCR混合物10~20 μL上样于15 g・L-1的琼脂糖凝胶电泳，切下含预期片段的胶块，利用Qiagen的DNA凝胶回收试剂盒从胶块中回收DNA. 以此DNA为模板，组配4个2次PCR反应：反应体积50 μL，含模板1 ng, 引物各25 pmol, 4种dNTP各 mmol・L-1, Taq酶 U, MgCl2　mmol・L-1，分别扩增ALD1, ALD2, ALD3, ALD4，扩增条件统一为：94℃预变性2 min后，按94℃ 30 s, 50℃ 30 s, 72℃ 60 s进行10~15个循环，最后一个循环结束后继续在72℃延伸9 min. 用Qiagen的PCR产物纯化试剂盒直接从PCR混合液中纯化PCR产物. 将纯化的4个片段连同相应PCR引物，寄上海博亚生物技术有限公司进行序列测定.
　　1．2．2基因组DNA片段扩增和限制性内切酶分析患者及其家庭成员的外周血基因组DNA使用Qiagen的DNA提取试剂盒提取. 根据突变所在部位，用Omiga 软件设计针对外显子6全长序列的PCR引物，上游引物(PA5F)序列为：5′CTGCGCTCTCTGGCGTCA3′，下游引物序列为：5′CACAGCCCGTCTCTGGCT3′，预期扩增片段长330 bp. 扩增条件：95℃预变性4 min后，按94℃ 30 s, 55℃ 30 s, 72℃ 30 s进行30个循环. 用Qiagen的PCR产物纯化试剂盒从PCR混合液中纯化PCR产物. 根据突变的性质，用限制性内切酶BspLI对纯化的PCR产物进行酶切, 于100 g・L-1聚丙烯酰胺凝胶上电泳, 溴化乙啶染色后用美国BioRad公司的FluorS型凝胶成像仪采集电泳结果.
　　2结果
　　2．1ALD基因mRNA的RTPCR扩增及测序用长链RTPCR试剂盒对患者外周血ALD基因mRNA的整个编码区进行扩增，可获得预期的扩增片段，也可见一些非特异性片段. 为提高特异性，并获得足够的PCR产物，先从凝胶中回收上述覆盖整个编码区的扩增产物，然后分4段进行第2轮PCR反应. 2次PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果(Fig 1)，14依次是ALD4, ALD3, ALD2和ALD1，4个片段均获得特异性扩增，其大小与预期完全相符. 直接用Qiagen试剂盒从2次PCR混合物中纯化ALD1, ALD2, ALD3, ALD4 4个片段后，用美国ABI公司的BigDye系统分别对其进行序列测定. 正常对照(Fig 2A)和患者(Fig 2B)ALD3片段部分序列， 序列下划线处示发生突变的密码子部位. 结果显示，患者ALD基因mRNA仅有一个碱基发生改变，即第508个密码子发生了CCC→CTC的改变，使正常的脯氨酸被亮氨酸替换. 正、反向测序结果一致.
　　图1-图2 　(略)
　　2．2限制性内切酶分析以患者及其家庭成员的基因组DNA为模板，扩增突变所在的ALD基因第6外显子，扩增片段330 bp. 正常情况下，该片段内含有2个BspLI酶切位点，酶切后产生72, 34和224 bp 3个片段. 患者第508密码子的CCC→CTC突变导致72与34 bp片段之间的酶切位点消失，酶切结果产生106和224 bp 2个片段. 酶切后的电泳结果(Fig 3)，可以看出：患者父亲和妹妹的酶切模式为正常人模式，患者的酶切模式与预期相符，患者母亲的酶切图谱中既有106和224 bp两个片段，也有72和34 bp两个片段，为杂合子. 以上结果还经过对330 bp片段的直接序列测定证实.
　　图3患者及其家庭成员ALD基因外显子6扩增产物的酶切分析　(略)

　　3讨论

　　本患者6岁起病，以进行性视力下降等中枢神经系统症状为主，病程进展迅速，头部MRI查出典型的大脑顶枕部长T1和长T2信号病灶，血浆极长链饱和脂肪酸浓度升高，符合儿童大脑型ALD的临床诊断［1］.
　　ALD表现出高度的遗传异质性. 根据有关国际权威数据库统计，目前在全球ALD患者中已鉴定出500多个ALD基因突变， 其中有一半以上仅见于单一家系. 本病在临床表现方面也是高度异质的，同一家族的不同患者在起病时间和临床症状上也往往不尽相同［3］. 表现型的异质性说明开展临床基因诊断的必要性，但遗传的高度异质性又使临床基因诊断的开展面临较大困难.我们曾报道在中国ALD患者发现的第1个基因突变［2,4］，本例P508L突变是在中国人群发现的第2个ALD基因突变. 查阅国内外文献，尚未见有关此突变的报道. 以下几点支持该突变是病理性突变的观点：① 患者的ALD基因的整个编码区只存在一个碱基改变，其余部分与正常对照的序列和GenBank参考序列一致；② 患者父亲和妹妹的ALD基因不存在该突变，其母亲为携带者，与ALD作为X染色体隐性遗传病的特点符合；③ 突变使ALDP的第508位氨基酸由Pro变成另一个与之性质差别较大的Leu；④ 突变所改变的氨基酸位于ALDP功能区ATP结合区保守序列内［5］；⑤ 1999年Takano等曾报道在紧邻的第507位氨基酸发生的一个突变，即G507V［3］. 该突变具体如何影响ALDP的结构和功能，有待进一步研究.

　　以往ALD基因的突变分析在技术上大多采用常规RTPCR方法：先合成cDNA，然后分段对cDNA进行扩增［6］. 我们将新开发的长链RTPCR技术引入ALD基因的突变分析中：先扩增ALD基因mRNA编码区全长，然后分段进行2次PCR扩增. 该技术途径简化了操作，提高了重复性，减少了引物数. 该技术途径在本研究的成功应用，将为今后其他患者的基因诊断带来便利.
　　【参考文献】
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　　［4］ Lan FH. Molecular diagnostics in China ［J］. Clin Chem Lab Med, 2001; 39(12):1190-1194.
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　　［6］ Lachtermacher MBR, Seuanez HN, Moser AB, Moser HW, Smith KD. Determination of 30 Xlinked adrenoleukodystrophy mutations, including 15 not previously described ［J］. Hum Mut, 2000; 15: 348-353.