人胚胎生殖细胞体外培养条件的优化及细胞移植的实验研究.docx

人胚胎生殖细胞体外培养条件的优化及细胞移植的实验研究
【摘要】 目的：优化人胚胎生殖细胞的体外培养体系，并将生长状态良好的传代的人EG细胞移植用于大鼠心肌梗死模型的治疗，探讨人胚胎生殖细胞进行异种移植对大鼠心肌梗死的治疗机制。方法：取5~10周人胚胎生殖腺嵴和背侧肠系膜，用添加和不添加细胞因子的两种培养体系对比进行组织块原代及传代培养，选取生长情况良好的传至第4代的人EG细胞，移植到急性心肌梗死大鼠的梗死心肌周围，分别于移植后1天、1、2、4周处死大鼠，以鼠抗人细胞核抗体MAB1281作为示踪剂[1]，通过免疫组化方法检测移植细胞的分布。结果：在培养液中添加LIF和b-FGF后原代及传代培养的人EG细胞生长旺盛，形成集落更早，传到第4代形成的集落体积变化不大；移植组人EG细胞在移植后1天、1周、2周、4周均可以在心梗区域观察到MAB1281阳性细胞。结论：添加LIF和b-FGF的培养体系是更高效的人EG细胞培养体系。人EG细胞可异种移植，人EG细胞在大鼠心肌梗死处由心外膜层逐渐向心肌层迁移。
【关键词】 人胚胎生殖细胞；白血病抑制因子；碱性成纤维细胞生长因子；心肌梗死；细胞移植
[Abstract] Objective: To optimize the culture system of hEGcs in vitro, select the hEGcs from subculture to transplant directly to the rat infarcted myocardium and observe the therapeutic mechanism of their heterotransplantation in the treatment for the rat myocardial infarction. Methods: The hEGcs from the gonadal ridges and dorsal mesenteries of human embryos aged 5-10 weeks were cultured with or without cytokine in culture medium to observe their growth and the effects of different cell culture systems were compared. The hEGcs’ from passage 4 were transplanted directly to infarcted myocardium. The rats with acute myocardial infarction were separately sacrificed at the end of 1 day, 1 week, 2 weeks, and 4 weeks after implantation. A monoclonal antibody specific for human cellular nuclei (MAB1281) was used to identify hEGCs and to observed the survival , migration and distribution of transplanted cells. Results: hEGcs grew better in the medium added with LIF and bFGF , the shape of the clusters was well maintained in the passage 4. Conclusions: The medium added with LIF and bFGF is efficient .The hEGcs can be used in heterotransplantation ,and the transplanted cells migrate from the epicardium to the myocardium and differentiate into cardiac myocytes gradually.
[Key Words] Human embryonic germ cell ; LIF ; bFGF ; Myocardium infarction ; Cell transplantation
随着人们物质生活水平的提高，饮食结构的变化，以及我国人口的老龄化，急性心肌梗死已经成为危害国民健康的主要疾病之一。目前尚无确切证据表明心肌本身存在特异的干细胞，成熟心肌细胞属于终末分化细胞，丧失再生能力，仅仅局限于存活部分的心肌,不能有效修复心肌组织。因此心肌梗死后坏死的心肌只能由成纤维细胞取代，形成无收缩功能的瘢痕组织，最终导致心力衰竭而威胁生命。因此，寻求一种更新更好的治疗手段，成为临床的当务之急。
用干细胞作为种子细胞运用细胞移植的方法，进行急性心肌梗死的治疗，目前越来越受到研究人员的关注，早在1996年Klug等已开始了ESCs在体心肌细胞成形术研究。人胚胎生殖细胞是源于人原始生殖细胞的一类胚胎干细胞。与来源于胚泡内细胞群的ES细胞相似，同样具有自我更新能力，多向分化潜能及无限增殖能力。目前还没有人EG细胞移植治疗心肌梗死的报道。因此本实验进行了体外培养的人胚胎生殖细胞植入大鼠梗死心肌部位的研究，希望最终能为心肌梗死治疗提供新的思路，为干细胞的临床应用奠定基础。
1 材料与方法
　主要试剂 DMEM培养基 、胎牛血清、碱性成纤维细胞生长因子、白血病抑制因子、培养液A：DMEM液+15%胎牛血清+ mol/Lβ-巯基乙醇+2 mmol/L谷氨酰胺+100 U/ml青霉素+100 U/L 链霉素、培养液B：DMEM液+15%胎牛血清+ mol/Lβ-巯基乙醇+2 mmol/L 谷氨酰胺+100 U/ml青霉素+100 U/L 链霉素 +1000 U/ml hLIF +1 ng/ml bFGF[30]、胰蛋白酶及EDTA、MAB-1281、正常山羊血清 、EnVision检测试剂盒。
　胚胎来源 收集苏州大学附属第二医院妇产科，苏州市妇幼保健中心人工中止妊娠的5~10周人胚，每例胚胎均经孕妇和道义委员会同意，胚胎需完整，无严重污染。
　人EG细胞的原代培养 取5~10周流产胚胎，在流产后6 h内，于超净工作台内，用含双抗的无Ca2+、Mg2+的PBS冲洗胚胎，将胚胎移入无菌培养皿，打开胚体体腔，去除内脏，将背侧肠系膜及两边的生殖嵴从胚体背侧撕下，用含高浓度双抗的无菌PBS冲洗组织块数次，将取出的组织切成1 mm3左右的小块。将切碎的组织块移入4个培养瓶内，两瓶滴加少量培养液A， 两瓶滴加少量培养液B。于37 ℃、5%CO2条件下培养，24 h后加入足量培养液。以后每2天半量换液，每日于倒置显微镜下观察细胞生长状态。
　人EG细胞的传代培养 挑选细胞已铺满瓶底的培养瓶，弃去瓶内培养液，用%胰蛋白酶-%EDTA溶液1~2 ml消化细胞，2~4 min后，镜下观察，当人EG细胞集落开始分散形成由数个细胞组成的细胞团时，加入3 ml与原培养液相同的A或B培养液终止消化。用吹管将细胞吹打成单细胞悬液，吸出一半移入另一个培养瓶，于37 ℃、5% CO2条件下培养，次日换液。追踪观察传代细胞的生长状况。
　移植细胞的制备 移植前1 h，以无菌接种针挑取传代培养至第4代人EG细胞集落，%胰蛋白酶-%EDTA消化，待细胞发生胞质回缩，细胞集落分散开时，即加含血清培养基终止消化，用吸管反复轻轻吹打瓶底，使细胞成为均匀的单细胞悬液，用无菌PBS离心洗涤2次，将细胞吹打均匀，计数板计数，调密度至1×106／ml。以微量注射器吸取50 μl，置4 ℃待用。
　实验动物分组及心肌梗死模型制作 将体重200~250 g SD大鼠40只随机分为2组：急性心肌梗死+人EG细胞;大鼠心肌梗死后在梗死区边缘分四点注射各点注入12 μl细胞悬液；急性心肌梗死对照组：大鼠心肌梗死后在梗死区边缘分4点注射各点注入12 μl PBS。具体步骤参照文献。建模成功后即在心肌梗死区边缘用微量注射器分4点注射，各点注入12 μl人EG细胞悬液，密度为1×106／ml，对照组以同样方法注入等量的无菌PBS。关胸，维持辅助呼吸至自主呼吸恢复，送回笼中饲养。术后肌肉注射青霉索40 U以预防感染，并在30 ℃条件下苏醒。全手术过程为无菌操作，术后不需拆线。
　免疫组织化学法鉴定 移植后1 d、1、2、4周，分别取7只移植组和3只对照组大鼠，用4%水合氯醛腹腔注射麻醉，取出心，PBS冲洗血液，去除左右心房和右心室，将左心室部位用4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，连续切片，石蜡切片采用二步法进行免疫组织化学标记，一抗分别为鼠抗人细胞核单抗，二抗为通用型二抗，显微镜下观察。实验严格按照说明书进行操作。
　　2 结 果
　人EG细胞在培养液A中的生长状态 组织块培养24 h后，有少量单个的人EG细胞及胚胎成纤维细胞游离出组织块，人EG细胞为圆形，核圆，核质比高，折光性强；人胚胎成纤维细胞为梭形或多边形，贴壁生长。培养48 h后，人EG细胞及人胚胎成纤维细胞均增多，人EG细胞3~5个聚集在一起形成小的细胞团。培养8 d可见单个人EG细胞明显减少，组织块周围出现圆形或椭圆形的正在形成中的人EG细胞集落，集落边缘尚不清晰，集落里细胞密集，细胞间界限不清；人胚胎成纤维细胞铺满瓶底。传代后，24 h，单个人EG细胞与人胚胎成纤维细胞混合生长，48 h后，任成纤维细胞生长旺盛，人EG细胞开始聚集成有10~15个细胞组成的细胞团。传至第4代人EG细胞集落明显变小。
　人EG细胞在培养液B中生长状态 组织块培养24 h后，较多人EG细胞及人胚胎成纤维细胞游离出组织块。 培养48 h，人EG细胞增殖旺盛，并形成由6~9个细胞构成的细胞团。培养6天，单个人EG细胞减少，组织块周围出现较多人EG细胞集落，集落呈圆形或鸟巢状，边缘清晰，人胚胎成纤维细胞铺满培养瓶底。传代后24 h，人EG细胞单个散在分布，可见少量胚胎成纤维细胞。48 h，人EG细胞生长旺盛，聚集成10~15个人EG细胞构成的细胞团块。传至第4代，人EG细胞集落大小同前。
　鼠抗人细胞核单克隆抗体检测结果 移植后1天，可见沿心外膜有MAB1281阳性表达的细胞，细胞为圆形，细胞核深棕褐色，排列无序；移植后1周，梗死区心肌纤维坏死，排列紊乱，在心肌细胞周围有棕色的MAB1281阳性表达的细胞分布，呈细长梭形；移植后2周，梗死区心肌层，MAB1281阳性表达的细胞呈长梭形，核卵圆形，被染为棕黄色，与心肌细胞平行排列；移植后4周，梗死区大部分为MAB1281阳性表达的细胞，细胞短柱形，细胞核棕黄色，心肌层细胞排列整齐；对照组MAB1281阴性表达。
3 讨 论
白血病抑制因子(Leukemia inhibitor factor，LIF)也叫分化抑制因子，它的功能不仅限于抑制多潜能干细胞的分化，还具有刺激体外培养细胞的增殖和维持胚胎干细胞多能性的作用。LIF 受体广泛分布，在成骨细胞、神经细胞、脂肪细胞、胚胎癌细胞、ES细胞、EG 细胞、M1 白血病细胞及活化的巨噬细胞上都有该因子的受体。当 LIF 与细胞表面的 LIF受体结合，gp130 与 LIF受体形成异源二聚体，从而激活蛋白酪氨酸激酶，活化的 JAK 激酶催化gp130 胞浆区的酪氨酸磷酸化，信号转导及转录激活因子借其 SH2 结构域结合于 gp130 磷酸化的酪氨酸，得以靠近JAK 激酶而磷酸化和活化，活化的 STAT 形成同源二聚体并移向核内，结合于特定的 DNA 序列，调节特定基因的表达，抑制干细胞分化。
碱性成纤维细胞生长因子(Basic fibroblast growth factor，bFGF)是肝素结合生长因子家族成员，分子量 17 kD，具有诱导各种哺乳类正常二倍体细胞 DNA合成的功能。bFGF单独使用时，作用较小，常与其他因子联合使用。bFGF 刺激 PGCs 体外增殖的峰值在1 ng/ml左右。在含有 LIF 的培养基中加入 bFGF 获得的细胞克隆的一个突出特征就是细胞紧密堆积成细胞团。bFGF 与其受体的相互作用可以激活人 ES 细胞内磷脂酰肌醇3激酶-丝/苏氨酸蛋白激酶-蛋白激酶B路径，上调细胞外基质(extracellular matrix, ECM) 分子的表达，ECM 分子能促进人胚胎干细胞增殖并使其保持未分化状态。
本实验室曾用酶联免疫吸附试验测定了不添加细胞因子的培养体系中LIF和bFGF在不同培养时间的含量，结果显示培养体系中胚胎成纤维细胞能够分泌足够的LIF和bFGF在人EG细胞的原代及传代培养过程中能够不发生分化，维持其多能性。但在本实验过程中发现，在培养液中添加LIF和bFGF后人EG细胞增殖速度加快，增殖旺盛，原代培养形成细胞集落的时间比在培养液A中早2天左右。这可能是由于在一定范围内，LIF、bFGF的含量与人EG细胞的增殖速度呈正相关所致。Hong等也发现bFGF因子在极低浓度到2 ng/ml之间,其刺激青鳉胚胎干细胞(MBE)增殖的作用呈线性增长趋势,MBE细胞几乎增长了3倍;当浓度在5~20 ng/ml时,其刺激效应仍在增强,但不再明显。培养液B中传代细胞中人EG细胞比例较培养液A中的高，这也说明了添加的LIF，bFGF使人EG细胞生长速度加快，促进其增殖。在传4代后，培养液B中的人EG细胞集落数多于体系A，且体积更大，这可能是由于培养液B中细胞因子的浓度较稳定，而培养液A由于胚胎成纤维细胞传代时间较长，细胞活性降低，不能提供足够的细胞因子所导致。 添加细胞因子后传4代所需平均时间为26天，而不添加细胞因子则需要32天，因此添加细胞因子的培养体系效率更高，更适合人EG细胞的体外培养增殖。
已有研究报道采用免骨髓间充质干细胞移植治疗心肌梗死[10]，本实验以鼠抗人细胞核单克隆抗体进行免疫组化检测结果显示：在大鼠梗死心脏局部移植入人EG细胞后1天，1、2、4周，人EG细胞逐渐由心外膜层迁移至心肌层，在梗死区边缘移植的人EG细胞，绝大部分向梗死区域内部迁移，极少数细胞向正常心肌区域迁移。这种趋向性迁移可能是由于组织损伤时存在的炎症反应[11]，表达多种趋化因子如白介素(IL)-8、单核细胞趋化蛋白(MCP21)、基质细胞衍生因子(SDF21)、肿瘤坏死因子等,同时血管内皮细胞多种黏附分子表达上调,白细胞、单核细胞浸润等等这一系列微环境的改变所引起的。人EG细胞向受损心肌迁移的具体信号途径和中心环节仍需进一步研究。
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