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基因工程的发展前景及应用
学院: 生科院 班级: 104 姓名: 沈劲松 学号: 10243336 等级:
摘要: 介绍了植物基因工程和动物基因工程的研究内容。植物基因工程在抗病虫害方面和动物基因在基因疫苗、 基因治疗和治疗的方法、 基因的调控、 基因调控的研究方法
关键词: 基因工程 基因疫苗 抗病虫
1.1 基因工程
基因工程( genetic engineering) 又称基因拼接技术和DNA重组技术, 是以分子遗传学为理论基础, 以分子生物学和微生物学的现代方法为手段, 将不同来源的基因按预先设计的蓝图 在体外构建杂种DNA分子, 然后导入活细胞, 以改变生物原有的遗传特性、 获得新品种、 生产新产品。基因工程技术为基因的结构和功能的研究提供了有力的手段。
1.1.2 基因工程的前景
基因工程师指按照人们的意愿, 进行严格的设计, 并经过体外DNA重组和转基因等技术, 赋予生物以新的遗传特性, 从而创造出更符合人们需要的生物类型和生物产品。
现状:基因工程自20世纪70年代兴起后, 在短短的40年间得到飞速的发展, 当前已成为生物开心的核心技术。基因工程在实际应用领域——农牧业, 工业, 环境, 能源和医药卫生等。
前景: 植物: 抗虫转基因, 抗病转基因等植物
动物: 用于提高动物生长速度, 改进产品的品质, 药物( 单克隆抗体等)
1.1.3 植物基因工程的含义及研究的主要内容
植物基因工程是指植物在植物学领域的基因, 其只要研究的对象是植物。植物基因的研究始于20世纪70年代, 在基因突变和有性杂交研究的基础上拓宽植物可利用的基因库, 进行基因转移, 采用分子生物学和基因工程技术将外源基因有目的有计划的插入整合到事先准备好的受体植物中, 使其在后一植株中得以遗传和表示, 从而使受体植物获得新的性状, 培养出优良品种。
植物基因工程不断发展, 当前以形成了一套较为成熟的植物基因转化技术, 构成了植物基因工程的研究内容, 主要内容包括一下几个方面:
⑴ 目的基因的获取, 供植物基因转化的基因能够来自植物本身, 也能够来自微生物和动物, 少数还能够人工合成, 一般以来自植物本身为主, 它有一些常见的技术: ①PCR技术 ②转做子示踪技术 ③基因组相减技术 ④染色体步查技术
⑵ 目的基因的修饰
⑶ 目的基因的转化到植物受体细胞的方法: ①将目的基因与运载体结合, 实际上不同来源的DNA重组过程 ②直接转移法。聚乙二醇、 多聚赖氨酸、 多聚鸟氨酸等, 特别是聚乙二醇是常采用的协助基因转移的聚合物。点击法、 基因枪法是常见的方法。另外, 还有激光法、 微束穿孔法、 显微注射法、 脂质介导法等。
⑷ 植物转化细胞的筛选和转基因植物细胞的组织培养。当前, 转化细胞与未转化细胞的区分及未转化细胞的淘汰常采用抗生素抗性基因和抗除草剂基因。即筛选标记基因和筛选试剂, 为了实现有效的转化必须依据转化材料和方法选择合适的抗性基因和筛选试剂。
⑸ 目的基因的表示和鉴定。
1.1.4 植物基因工程在抗病虫害方面的应用
据不完全统计,全世界农作物每年因病虫害造成的损失约占其总产量的37 % ,其中13 %是由虫害引起的 。植物虫害使全世界每年大约损失数千亿美元,美国在小菜蛾的防治上所耗费用达10 亿美元,作物产量损失为4000 多万T ,中国因虫害每年造成田间作物减产水稻达10 % ,小麦近20 % ,棉花则达30 %以上。当前,对农作物病虫害的防治主要依赖化学药物。化学药物对害虫的防治起到重要的作用,同时也有成本高、 污染环境、 易残留、 会毒害有益的昆虫及害虫的天敌等弊端。
基因工程的发展为培育抗病虫的作物提供了新的手段。利用基因工程手段培育抗病虫害作物品种可克服常规育种的不足: (1) 它不但利用存在于植物中的抗病虫基因,还能够利用某些动物、 微生物中的抗性基因,将其重组到植物染色体上,并使之在植物体内特定地遗传及表示,从而产生抗病虫害性状,因此基因资源非常丰富。(2) 培育出的抗病虫新品种可控制任何时期植物任何部位发生的病虫害。(3) 育种周期短、 成本低。(4) 利用基因工程培育抗病虫作物品种还具有不污染环境及抗病虫物质不易被环境因素所破坏的优点。当前,人们已发现并分离到了许多有用的抗虫基因,有的抗虫基因已导入植物体内而获得了转基因抗虫植物,有的转基因抗虫作物进入了大田试验,展现出了美好的应用前景,转抗虫基因的烟草、 棉花在一些国家已进入商品化生产。已克隆得到的抗虫基因根据它们的来源可分为三类:第一类是从细菌中分离出来的抗虫基因,主要是苏云金杆菌杀虫结晶蛋白(Bt) 基因;第二类是从植物组织中分离出的抗虫基因,主要为蛋白酶抑制剂基因、 淀粉酶抑制剂基因、 外源凝集索基因等,其中应用最广泛的是豇豆胰蛋白酶抑制剂基因(CpTi) ;第三类是从动物体内分离的毒素基因,主要有蝎毒素基因和蜘蛛毒素基因等。
1987 年比利时的Vacek 研究小组、 美国Monsanto 公司Fischhoff 等人报道了首例有关转Bt 基因烟草和番茄的研究结果,此后Bt 基因相继被转入到棉花、 水稻、 玉米、 苹果和核桃等农作物中,是当前世界上应用最为广泛的生物杀虫剂。据粗略统计,当前已经有60 多种Bt 基因被报道。美国是育成世界上首例抗虫棉的国家,中国是继美国后育成抗虫转基因棉的第二个国家,育成的中国第一代单价抗虫棉,抗虫性90 %以上,减少用药60 %～80 % ,增产30 %～40 %。1992 年底中国农科院生物技术研究中心的郭三堆等人在国内首先人工合成了Bt 基因之后,又对豇豆胰蛋白酶抑制剂(CpTi) 基因进行了修饰,构建了同时带有这两种基因的双价杀虫基因高效植物表示载体,再经过花粉管通道转化技术导入中国不同棉花生产区的主栽品种,已获得了数十个双价转基因抗虫棉株系。南京农业大学等单位培育出的转基因抗虫棉—南抗3 号,具世界该种业领先水平。南抗3 号是中国”863”重点攻关科技项目,该品种具有较好的丰产性、 优质性和适应性,产量比国外基因棉种增产20 %以上。这一成果引起世界农业专家和跨国种业公司的强烈关注和震惊。许多国家都投入大量资金研究开发利用转基因抗虫农作物新品种。Bt 抗虫棉在美国、 澳大利亚、 南非和中国已被批准商业化释放 ;Bt 土豆在美国、 加拿大和日本实现了商业化;Bt玉米在美国、 加拿大、 阿根廷、 日本和欧共体也进入了市场。这些转基因作物能减少杀虫剂和农药的用量,降低杀虫剂和农药及其残留物对食物链、 水体造成的污染,从而有利于保护生态环境。相信在不远的将来会有更多的转基因抗虫农作物新品种问世。
抗病
长期以来,植物病害的防治主要靠抗病育种和合理栽培管理。采用有性杂交的方式来获得抗病品种存在着各种局限性,因为抗性基因是受多基因控制,而且往往与一些不良基因连锁在一起,而基因工程则是在单个目的基因上进行,具有快速性和定向性。另外抗病品种存在选育时间长、 抗性容易退化等问题。
1986 年美国科学家Beachy 将烟草花叶病毒(TMV) 外壳蛋白基因导入烟草获得了首例抗病毒转基因烟草。大田实验结果表明,在接种了TMV 以后,转基因植物只有约5 %的植株得病, ,而对照植株的发病率为99 %。在抗病毒基因工程中,当前主要采用的方法是将病毒的外壳蛋白(CP) 基因导入植物,使番茄、 黄瓜、 南瓜、 甜椒等植物具有抗病性。1992 年美国国家科学院公布了Hayakawa 研究小组利用禾谷类作物抗病毒外蛋白技术获得成功。
中国也获得了多种转基因抗病毒植物,如将合成的CMV 和TMV 外壳蛋白基因用Ti 质粒介导引入烟草良种NC89 ,得到了TMV/ CMV 的转基因烟草,并已获大面积推广。1999 年美国批准转基因抗病毒马铃薯、 西葫芦、 番木瓜品种进行生产后,中国也有转基因抗病毒烟草、 番茄和甜椒品种被批准商业化应用。荷兰的一家植物生物技术公司应用转基因技术培育出一种抗真菌草莓新品种,不但能减少草莓的病害,并能延长草莓的保鲜期。
1.2 动物基因工程含义及应用
动物细胞原称遗传工程, 是应用DNA重组技术, 按照人们的意愿在基因水平上改变生物遗传性, 创造新生物物种经过工程化为人类提供有用产品及服务的技术。或指应用现代化的生物科学和遗传学技术, 对动物基因进行操纵或改造的科学工程。
1.2.1 基因疫苗
疫苗概念: 凡具有抗原性接种于机体可产生特异的自动免疫力, 可抵御感染病的发生或流行, 总称为疫苗。既往把以细菌制备的制剂称为”菌苗”; 而把病毒及立克次氏体制备的制剂称为”疫苗”; 以细菌代谢产物——毒素制备的制剂称为”类毒素”。随着现代科学技术的发展, 有效抗原的纯化和提取, 基因重组抗原甚至日后将可能发展的人工合成抗原等, 难以抗原类别命名。按国际惯用名称, 凡自动制剂统称为”疫苗”。
　　基因疫苗指的是DNA疫苗, 即将编码外源性抗原的基因插入到含真核表示系统的质粒上, 然后将质粒直接导入人或动物体内, 让其在宿主细胞中表示抗原蛋白, 诱导机体产生免疫应答。抗原基因在一定时限内的持续表示, 不断刺激机体免疫系统, 使之达到防病的目的。
基因工程疫苗: 是用基因工程方法或分子克隆技术, 分离出病原的保护性抗原基因, 将其转入原核或真核系统使表示出该病原的保护性抗原, 制成疫苗, 或者将病原的毒力相关基因删除掉, 使成为不带毒力相关基因的基因缺失苗。①多肽或亚单位疫苗。②颗粒载体疫苗。③病毒活载体疫苗。④细菌活载体疫苗。⑤基因重配疫苗。⑥基因缺失疫苗。如乙肝疫苗。
1.2.2 基因治疗
基因治疗当前主要是治疗那些对人类健康威胁严重的疾病, 包括: 遗传病( 如血友病、 囊性纤维病、 家庭性高胆固醇血症等) 、 恶性肿瘤、 心血管疾病、 感染性疾病( 如艾滋病、 类风湿等) 。基因治疗与常规治疗方法不同: 一般意义上疾病的治疗针正确是因基因异常而导致的各种症状, 而基因治疗针正确是疾病的根源--异常的基因本身。基因治疗有二种形式: 一是体细胞基因治疗, 正在广泛使用; 二是生殖细胞基因治疗, 因能引起遗传改变而受到限制。
1.2.3 基因治疗的方法
( 1) 特异正常基因的分离与克隆: 应用重组DNA和分子克隆技术结合基因定位研究成果, 已有不少基因并将会有更多人类基因被分离和克隆, 这是基因治疗的前提, 在当代分子生物技术条件下, 一般来说, 只要有基因探针和准确的基因定位, 任何基因都可被克隆。除此, 现在既可人工合成DNA探针, 还可用DNA合成仪在体外人工合成基因, 这些都是在基因治疗前, 分离克隆特异基因的有利条件。
　　( 2) 外源基因的转移: 基因转移( gene transfer) 是将外源基因导入细胞内, 其转移方法较多, 常见的要有下列几类:
　　1) 化学法: 将正常基因DNA( 及其拷贝) 与带电荷物质和磷酸钙、 DEAE－葡萄糖或与若干脂类混合, 形成沉淀的DNA微细颗粒, 直接倾入培养基中与细胞接触, 由于钙离子有促进DNA透过细胞有作用, 某些化合物可扰乱细胞膜, 故可将DNA输入细胞内, 并整合于受体细胞的基因组中, 在适当的条件下, 整合基因得以表示, 细胞亦可传代。这种方法简单, 但效率极低, 一般1000－100000个细胞中只有一个细胞可结合导入的外源基因。要达到治疗目的, 就需要从病人获得大量所需的受体细胞。当然, 能够经过选择培养的方法来提高转化率。
　　2) 物理法: 包括电穿孔法和直接显微注射法。
　　①电穿孔法: 电穿孔法( electroporotion) 是将细胞置于高压脉冲电场中, 经过电击使细胞产生可逆性的穿孔, 周围基质中的DNA可渗进细胞, 但有时也会使细胞受到严重损伤。
　　②显微注射法: 显微注射( microinjection) 是在显微镜直视下, 向细胞核内直接注射外源基因, 这种方法应是有效的。但一次只能注射一个细胞, 工作耗力费时。此法用于生殖细胞时, 有效率可达10%。直接用于体细胞却很困难。在动物实验中, 应用这种方法将目的基因注入生殖细胞, 使之表示而传代, 这样的动物就称为转基因动物, 当前成功使用得较多的是转基因小鼠( transgenic mice) , 它可作为繁殖大量后代的疾病动物模型。
　　③脂质体法: 脂质体( liposome) 法是应用人工脂质体包装外源基因, 再与靶细胞融合, 或直接注入病灶组织, 使之表示。
　　3) 同源重组法: 同源重组( homologous recombination) 是将外源基因定位导入受体细胞的染色体上, 在该座位因有同源序列, 经过单一或双交换, 新基因片段替换有缺陷的片段, 达到修正缺陷基因的目的。如在新基因片段旁组装一Neo基因, 则在同源重组后, 因有Neo基因, 可在含有新霉素 neomycin) 的培养基中生长, 从而使未插入新基因片段的细胞死亡。对于体细胞基因治疗, 体外培养细胞的时间不能过长, 筛选量大, 故在临床上应用也受限制难以进行。今后如能改进技术, 提高重组率, 这种定点修正基因的方法仍是有前景的。
　　4) 病毒介导基因转移: 前述的化学和物理方法都是经过传染方式基因转移。病毒介导基因转移( viral mediatedgene transfer) 是经过转换方式完成基因转移, 即以病毒为载体( vector) , 将外源目的基因经过基因重组技术, 将其组装于病毒上, 让这种重组病毒去感染受体宿主细胞, 这种病毒称为病毒运载体( viral vector) 。当前应用的有两种病毒介导基因转移方法。
①反转录病毒载体: 反转录病毒虽是RNA病毒, 但有反转录酶, 可使RNA转录为DNA, 再整合到宿主细胞基因组。反转录病毒载体有以下的优点首先是具有穿透细胞的能力, 可使近100%的受体细胞被感染, 转化细胞效率高; 其次, 它能感染广谱动物物种和细胞类型而无严格的组织特异性; 再者随机整俣的病毒可长期存留, 一般无害于细胞, 但也存在缺点: 这种载体只能把其DNA整合到能旺盛分裂细胞的染色体, 而不适合于那些不能正常分裂的细胞, 如神经元。最严重的问题是由于病毒自身含有病毒蛋白及癌基因, 就有使宿主细胞感染病毒和致癌的危险性。因此 人们有目的地将病毒基因及其癌基因除去, 仅留它们的外壳蛋白, 以保留其穿透细胞的功能, 试图避免上述缺点。这种改造后的病毒称为缺陷型病毒( defective virus) 。这样的病毒中的反转录酶可将RNA转化为DNA, 有助于该DNA顺利进入宿主细胞的基因组, 而该病毒则死亡。由于病毒整合基因组是随机的, 因此还是可能激活细胞的原癌基因, 以及因随机插入发生插入突变。
1.2.4 基因调控
基因表示的主要过程是基因的转录和信使核糖核酸(mRNA) 的翻译。基因调控主要发生在三个水平上, 即①DNA水平上的调控、 转录控制和翻译控制; ②微生物经过基因调控能够改变代谢方式以适应环境的变化,
这类基因调控一般是短暂的和可逆的; ③多细胞生物的基因调控是细胞分化、 形态发生和个体发育的基础, 这类调控一般是长期的, 而且往往是不可逆的。基因调控的研究有广泛的生物学意义, 是发生遗传学和分子遗传学的重要研究领域。
经过基因调控, 微生物能够避免过多地合成氨基酸、 核苷酸之类物质。如果使它们的调节基因发生突变, 就能够得到大量合成这些物质的菌种, 把这些菌种用在发酵工业上, 使产量大幅度增长。在遗传工程的研究中应用基因调控的原理可使外源基因表示(见重组DNA技术) , 因此基因调控的理论探讨还具有生产实践意义。
1.2.5 基因调控的研究方法
筛选突变型
　　这是在原核生物中广泛应用的方法, 例如在乳糖操纵子的研究中筛选失去了基因调控能力的组成型, 包括调节基因发生突变和操纵基因发生突变的突变型, 以及筛选即使有乳糖或其它诱导物存在的情况下依然不能合成β-半乳糖糖苷酶的超阻遏型等等。
激素诱导
　　在高等的真核生物中, 除了离体培养的体细胞以外( 见体细胞遗传学) , 一般较难得到上述那些突变型。因此常利用激素能诱导产生特定蛋白质的现象来研究编码这些蛋白质的基因调控。
离体生化方法
　　真核生物的染色体主要由 DNA和蛋白质组成。因此分别抽提这些成分然后逐一添加其它成分再进行离体转录或离体翻译的测定, 这也是真核生物基因调控研究中经常采用的研究手段。分子杂交、 电镜观察以及各种一般的生物化学方法都是基因调控的重要研究手段。
重组DNA技术
许多基因, 包括只在某一发育阶段活动的基因( 见基因文库) 都能够从基因组中分离出来进行研究。应用核酸的顺序分析技术能够测定基因的核苷酸顺序。再应用体内与体外的基因表示系统就能直接了解基因调控的机制。
参考文献
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