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第一章 基因工程概论
1、 什么是基因工程?
在体外对不同生物的遗传物质( 基因) 进行剪切、 重组、 连接, 然后插入到载体分子中( 细菌质粒、 病毒或噬菌体DNA), 转入微生物、 植物或动物细胞内进行无性繁殖, 并表示出基因产物。
2、 基因工程诞生的三个理论基础是什么?
1 . DNA是遗传物质
2. DNA双螺旋结构
3. 中心法则和遗传密码
3、 基因工程诞生的六个技术突破?
1. 限制性内切酶( restriction enzymes)
2. DNA连接酶( ligase)
3 载体( vector)
4. 感受态体系
5. 琼脂糖凝胶电泳
6. DNA测序技术
4、 基因工程的诞生的标志?
1. Berg的开创性实验
2. Boyer-Cohen实验
5、 基因工程的主要操作内容包括哪些?
1. 目的基因的获取
从复杂的生物基因组中, 经过酶切消化或PCR扩增等步骤, 分离出带有目的基因的DNA片断。
2. 重组体的制备
将目的基因的DNA片断插入到能自我复制并带有选择性标记( 抗菌素抗性) 的载体分子上。
3. 重组体的转化
将重组体( 载体) 转入适当的受体细胞中。
4克隆鉴定
挑选转化成功的细胞克隆( 含有目的基因) 。
5.目的基因表示
　　使导入寄主细胞的目的基因表示出我们所需要的基因产物。
6、 基因工程存在哪些安全隐患?
1. 对环境的影响
　　重新组合一种在自然见尚未发现的的生物性状有可能给现有的生态环境带来不良影响。
2. 新型病毒的出现
　　制造带有抗生素抗性基因或有产生病毒能力的基因的新型微生物有可能在人类或其它生物体内传播。
3. 癌症扩散
　　将肿瘤病毒或其它动物病毒的DNA引入细菌有可能扩大癌症的发生范围。
4. 人造生物扩散
新组成的重组DNA生物体的意外扩散可能会出现不同程度的潜在危险。

７.论述: 基因工程的应用有哪些?
一、 基因工程在农业生产中的应用
1. 提高植物的光合作用效率
( 1) 提高CO2的固定率
　　改变与光合作用有关的酶的结构和组成( 如二磷酸核酮糖羧化酶) 。
（2） 提高光能吸收率和转化率
　　改变光能交换系统的分子的基因结构。
2. 提高豆科植物的固氮效率
　　使非固氮植物转变为固氮植物或能与根瘤菌共生固氮。
3. 转基因植物
　　是农业生物技术的主要内容。
　　是将克隆到的特殊基因导入受体植物, 使之增加一些优质性状( 高产、 稳定、 优质、 抗虫、 抗病等) 。
4. 转基因动物
　　将外源基因导入动物细胞, 并在基因组内稳定整合, 遗传给后代。
　　使动物成为生物反应器生产有用的活性蛋白等。
二、 基因工程在工业中的应用
1. 纤维素的开发利用
　　克隆各种参与纤维素降解的酶的基因, 导入酿酒酵母, 就可能利用廉价的纤维素来生产葡萄糖, 发酵成酒。
2. 酿酒工业
　　用外源基因改造酿酒酵母, 产生优质的啤酒。或用酿酒酵母生产蛋白质等。
三、 基因工程在医药上的应用
1. 用转基因植物或动物生产药物
2. 用微生物生产药物
　　大肠杆菌或酵母菌生产激素( 如胰岛素) 、 干扰素等
3. 技术设计高效高特异性的生物制剂
　　应用定点突变技术设计蛋白质或酶的结构, 制造出高效高特异性的生物制剂
4. 研制疫苗
　　制造新型疫苗( 如HIV、 乙肝 丙肝、 霍乱、 痢疾、 SARS)
5. 基因诊断
6. 法医鉴定
7..基因治疗
将正常的外源基因导入靶细胞中以弥补靶细胞所缺失或突变的基因、 或抑制异常表示的基因。
四、 基因工程在环境保护中的应用
1. 检测水污染
用重组细菌或转基因鱼等检测水污染
2. 生物降解
用带有重组质粒的”超级菌”分解油( 烷烃类) 、 有机农药污染。

第二章 基因工程的酶学基础
1、 限制性核酸内切酶的概念及其功能
限制性核酸内切酶: 是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列( 4—8bp) , 并由此处切割DNA双链的核酸内切酶。
功能: 自我保护作用。
1) 限制( Restriction) 限制性内切酶将侵入细菌体内的外源DNA切成小片断。
( 2) 修饰( Modification) 细菌自身的DNA碱基被甲基化酶甲基化修饰所保护, 不能被自身的限制性内切酶识别切割。
2、 限制性内切酶的命名原则
1) 用属名的第一个字母和种名的头两个字母组成3个字母的略语表示寄主菌的物种名。
2) 用一个右下标的大写字母表示菌株或型。如Ecok, EcoR( 现在都写成平行, 如EcoRI) 。
3) 如果一种特殊的寄主菌内有几种不同的限制与修复系统, 用罗马字母表示。如EcoR I, EcoR V。
4) 限制酶前面要带上R( Restriction),
修饰酶前面要带上M( Modification) 。( 现已省略) 。
3、 限制性内切酶的有哪些类型? 各有什么特点?
I 型限制性内切酶
( 1) 识别位点序列
未甲基化修饰的特异序列。
EcoB: TGA(N)8TGCT
EcoK: AAC(N)6GTGC
（2） 切割位点
在距离特异性识别位点约1000—1500 bp处随机切开一条单链。
II 类限制性内切酶
（1） 识别位点序列
未甲基化修饰的双链DNA上的特殊靶序列( 多数是回文序列) 。
与DNA的来源无关。
（2） 切割位点
切开双链DNA。形成粘性末端( sticky end) 或平齐末端( blunt end)
III类限制性内切酶
在完全肯定的位点切割DNA, 但反应需要ATP、 Mg2+和SAM( S-腺苷蛋氨酸) 。
4、 II类限制性内切酶的作用特征有哪些? 什么是粘性末端? 有什么作用?
识别位点序列:
未甲基化修饰的双链DNA上的特殊靶序列( 多数是回文序列) 。
与DNA的来源无关。
切割位点:
切开双链DNA。形成粘性末端( sticky end) 或平齐末端( blunt end)
粘性末端: 含有几个核苷酸单链的末端。作用: ①连接便利② 5’末端标记③ 补平成平齐末端。
5、 什么是同裂酶? 有哪两类? 有什么特点?
同裂酶是识别位点的序列相同的限制性内切酶。
类别: ① 完全同裂酶: 识别位点和切点完全相同。
如Hind Ⅲ 和Hsu I。
② 不完全同裂酶: 识别位点相同, 但切点不同。
如Xma I 和 Sma I。
6、 什么是同尾酶?
识别的序列不同, 但能切出相同的粘性末端。如BamH I、 Bgl Ⅱ、 Bcl I、 Xho Ⅱ等
7、 什么是内切酶的星号( *) 活性?
如果改变反应条件就会影响酶的专一性和切割效率, 称为星号( *) 活性。
8、 影响限制性内切酶活性的因素有哪些?
1. DNA的纯度
2. DNA的甲基化程度
3. 温度
4. 缓冲液(Buffer)
9、 内切酶与识别序列的结合模式是什么?
经过X射线晶体衍射发现II类限制酶是以同型二聚体的形式与靶序列结合。
10、 限制性内切酶对DNA的消化作用有哪两种形式? 如何使反应终止?
1. 内切酶与识别序列的结合模式
2. 完全消化与局部消化
大多数酶可用65 oC温育5分钟失活。
或用乙醇沉淀DNA。
11、 什么是DNA 连接酶? 简述其类型及其作用特点和 DNA连接条件?
从细菌DNA环化现象推测, 必定存在一种能把两条DNA双链连接到一起的酶。
1. 两种DNA连接酶
( 1) 大肠杆菌连接酶: 只能连接粘性末端。
( 2) T4噬菌体的连接酶: 不但能连接粘性末端, 还能连接齐平末端。
2. 连接条件:
( 1) 必须是两条双链DNA。
( 2) DNA3’端有游离的-OH, 5’端有一个磷酸基团( P) 。
( 3) 需要能量: 动物或噬菌体中: ATP
大肠杆菌中: NAD+

12、 连接酶的连接反应的机理是什么?
1. ATP( NAD+)提供激活的AMP。
2. ATP与连接酶形成共价”连接酶-AMP”复合物, 并释放出焦磷酸PPi。

3. AMP与连接酶的赖氨酸e-氨基相连。
4. AMP随后从连接酶的赖氨酸e-氨基转移到DNA一条链的5‘端P上, 形成”DNA-腺苷酸”复合物。
5. 3‘-OH对磷原子作亲核攻击, 形成磷酸二脂键, 释放出AMP。
13、 影响连接反应的因素有哪些?
1. 插入片段与载体的浓度比例: 10~20倍。
2. 反应温度: 12.5℃, 一般14~16℃
14、 什么是DNA聚合酶? 基因工程中常见的DNA聚合酶有哪些类型?
DNA聚合酶( DNA polymerase) 是细胞复制DNA的重要作用酶。DNA聚合酶 , 以DNA为复制模板, 从将DNA由5'端点开始复制到3'端的酶。DNA聚合酶的主要活性是催化DNA的合成( 在具备模板、 引物、 dNTP等的情况下) 及其相辅的活性。
基因工程中常见的DNA聚合酶:
1.大肠杆菌DNA聚合酶
2. Klenow fragment
3. T7 DNA聚合酶
4. T4 DNA聚合酶
5. 修饰过的T7 DNA聚合酶
6. 逆转录酶
15、 常见的DNA聚合酶的特点有什么?
1. 共同特点: 把dNTPs连续地加到引物的3’—OH端。
2. 主要区别: 持续合成能力和外切酶活性不同。T7 DNA聚合酶能够连续添加数千个dNTPs而不从模板上掉下来。其它几种DNA聚合酶只能连续添加10多个dNTPs就会从模板上解离下来。
16、 论述: 主要DNA聚合酶在基因工程中的作用和主要用途
1. 大肠杆菌DNA聚合酶 I: 主要用来制备带放射性标记的DNA探针。
2. Klenow fragment: ① 3’端补平: 补平限制性内切酶切后形成的3’隐蔽端。
② DNA 3’末端标记: 在3’隐蔽端加上放射性标记的dNTP。
③ cDNA第二链的合成
3. T4 DNA聚合酶: ① 补平隐蔽末端
② DNA 3’末端标记: 用3’®5’外切酶活性作用于所有末端形式的3’端( 平端、 3’隐蔽端 5’隐蔽端) 制造出3’隐蔽端。再利用它的5’®3’聚合酶活性补平, 并加入放射性标记的dNTP。
4. T7 DNA聚合酶: ① 以大分子量DNA为模板的合成: 如M13
② 进行末端标记 : 与T4 DNA聚合酶相同。
③ 补平隐蔽末端: 合成补平3’隐蔽末端;
水解修平3’突出末端。
5. 修饰后的T7 DNA聚合酶: ① DNA测序: 双脱氧法。
② 标记DNA 3’隐蔽末端
③ 更有效地补平末端
6. 逆转录酶: ① 合成cDNA: 以oligo dT为引物( 与mRNA的polyA尾巴互补结合) 。
② 合成DNA探针: 用随机引物( random primer) 或oligo dT做引物。
17、 什么是DNA修饰酶?
DNA修饰酶能对进行化学修饰, 修饰的位点能够在碱基, 也能够在脱氧核糖。修饰的方法能够是甲基化, 乙基化等等。
18、 什么是末端脱氧核苷酸转移酶? 简述其作用及其作用特点和作用?
末端脱氧核苷酸转移酶是一种无需模板的DNA聚合酶, 催化脱氧核苷酸结合到DNA分子的3'羟基端。带有突出、 凹陷或平滑末端的单双链DNA分子均可作为TdT的底物。
( 1) 同聚物加尾: 给外源DNA片断和载体分子分别加上互补的同聚物尾巴, 以使它们有效地连接。
( 2) 再生酶切位点: 便于回收克隆片断。
( 3) 非放射性标记DNA片断的3’端: 催化非放射性标记物参入DNA片断的3’端。( 生物素-11-dUTP等)
19、 什么是T4多核苷酸激酶? 简述其功能及其作用?
分离自感染了噬菌体T4的大肠杆菌细胞, 可将ATP中γ磷酸基转移到具有5′端羟基的DNA或RNA分子上的酶。
功能: 催化磷酸从ATP转给双链或单链DNA或RNA的5’-OH端。
如果ATP的γ磷酸带有32P标记, 就会被转移到DNA的5’端。
作用: DNA 5’-OH端磷酸化、 标记DNA的5’端。
20、 什么是碱性磷酸酶? 简述其特性及其用途?
碱性磷酸酶是广泛分布于人体各脏器器官中, 其中以肝脏为最多其次为肾脏, 骨骼、 肠、 和胎盘等组织, 。这种酶能催化核酸分子脱掉5’磷酸基团, 从而使DNA或RNA片段的5’-P末端转换成5’-OH末端
特性: 催化脱掉DNA( 或RNA) 5’端的磷酸根。
用途: ( 1) 防止线性化的载体份子自我连接
21、 什么是核酸外切酶?简述核酸外切酶的种类及其主要酶活性和应用?
是一类从多核苷酸链的一头开始催化降解核苷酸的酶。
1. 核酸外切酶Ⅲ( exo Ⅲ) : 识别3’-OH, 在DNA双链的末端产生出单链区域。与klenow配合进行3’端标记
2. 核酸外切酶( λ exo) : 识别5’-P( 但不能降解5’-OH)
使DNA双链变成单链( 短) 。
3. T7基因6核酸外切酶: 既能识别5’-P, 又能识别5’-OH。用途与lλ exo一样。
22、 什么是S1核酸酶? 简述其特性及其功能和用途
S1核酸酶是催化降解单链DNA或单链RNA(对单链DNA的活性更高), 产生以5′-磷酸基末端的单核苷酸或寡核苷酸的酶。
特性: ( 1) 高度单链特异性( 2) 反应条件: ① 低水平Zn2+ ② pH4.0~4.3
功能: ( 1) 催化单链RNA或DNA降解。( 2) 切掉双链核酸中的单链区。( 3) 降解限制酶切形成的单链突出端。( 4) 不能降解双链DNA或RNA-DNA杂交链
用途: ( 1) 定位RNA( 2) 用mRNA测定基因中的外显子序列
23、 简述Bal 31核酸酶特性及其功能和用途
特性: 既有单链特异的DNA( RNA) 内切酶; 又有双链特异的DNA外切酶。
功能: 降解双链DNA或其上的单链缺口、 未配正确单链区域。
用途: 定位测定DNA片断中的限制酶位点分布。
第三章 基因工程载体
1、 什么是载体? 基因工程对载体的要求有哪些?
在基因工程操作中, 把能携带外源DNA进入受体细胞的DNA分子叫载体。
基因工程对载体 的要求:
( 1) 在宿主细胞内能独立复制。
( 2) 有选择性标记。
( 3) 有一段多克隆位点。外源DNA插入其中不影响载体的复制。
( 4) 分子量小, 拷贝数多。
( 5) 容易从宿主细胞中分离纯化。
2、 什么是质粒? 质粒的一般生物学特性有哪些? 其质粒空间构型与电泳速率有何关系?
质粒( plasmid) : 是独立于染色体以外的能自主复制的双链闭合环状DNA分子。
质粒的一般生物学特性: ( 1) 分子小: 1—200 kb
（2） 编码基因少: 2—3个中等大小的蛋白质。
( 3) 环形状: 双链环状DNA。
( 4) 质粒的空间构型: ① 共价闭合环状DNA( cccDNA)
② 开环DNA( open circular, ocDNA) ③ 线形DNA ( linear , lDNA)
质粒空间构型与电泳速率:
同一质粒尽管分子量相同, 不同的构型电泳迁移率不同: scDNA最快、 l DNA次之、 ocDNA最慢。
3、 什么是接合型质粒和非接合型质粒? 什么叫做质粒的迁移作用?
接合型质粒: 又叫自我转移型质粒。除了带有自我复制所必须的遗传信息外还带有一套控制细菌配对和质粒接合转移的基因。
非接合型质粒: 虽然带有自我复制所必须的遗传信息, 但失去了控制细菌配对和质粒接合转移的基因, 因此不能从一个细胞转移到另一个细胞。
质粒的迁移作用: 能使寄主染色体上的基因随其一道转移到原先不存在该质粒的受体菌中。
4、 质粒的复制类型有哪两类? 各有何特点? 什么是质粒不亲和性?
1. 严紧型质粒( stringent plasmid) : 拷贝数少, 只有1—3份拷贝。
2. 松弛型质粒( relaxed plasmid) : 拷贝数多, 有10—60份拷贝。
所谓质粒的不亲和性( plasmid incompatibility) , 有时也称为不相容性, 是指在没有选择压力的情况下, 两种亲缘关系密切的不同质粒, 不能够在同一个寄主细胞系中稳定地共存的现象。
5、 质粒载体必须具备的基本条件有哪些?
（1） 具有复制起点( ORI)
（2） 具有抗菌素抗性基因
（3） 若干限制性内切酶的单一位点
（4） 具有较小的分子量和较高的拷贝数。
6、 蓝白斑筛选的原理是什么?
① Xgal: ( 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-galactoside)
② b-半乳糖苷酶Xgal显色反应: bβ-半乳糖苷酶能把无色的化合物Xgal分解成半乳糖和一个深蓝色的物质5-溴-4-氯靛蓝。
③ lacZ的a肽互补
④ IPTG的诱导作用: IPTG是乳糖的类似物。能诱导lac操纵子的启动转录, 使受体菌基因组中的lacZ 的C端部分和载体的lacZ’a肽都表示。从而互补。
7、 人工构建的质粒载体有哪几种类型?
（1） 高拷贝数的质粒载体
（2） 低拷贝数的质粒载体
（3） 失控的质粒载体
（4） 插入失活型质粒载体
（5） 正选择的质粒载体
（6） 表示型质粒载体
8、 pSC101载体、 ColE1载体、 pBR322载体的主要特点?
1. pSC101: 第一个成功地用于克隆实验的大肠杆菌质粒载体。
2. ColE1: 在培养基中加入氯霉素抑制细菌蛋白质合成后, 质粒依然能复制达到每个细胞1000-3000拷贝之多!
3. pBR322: F. Bolivar和R.L. Rodriguez人工构建载体。
9、 pUC系列载体的特点和优点?
特点: 约2.7kb, 10个连续的单一限制酶切位点 位于lacZ’基因的5’端。Ampicillin 抗性和 lacZ的a肽互补( 蓝白斑) 相结合。
优点: ① 更小的分子量: 如pUC18为2682bp, pUC8为2750bp。
② 选择方便
③ 克隆便利: 具有多克隆位点( MCS) , 使有两个不同粘性末端的外源DNA方便地插入。
④ 测序方便
10、 pGEM-3Z载体的特点?
① 如果加入纯化的T7或SP6 RNA聚合酶, 在试管里就能够转录mRNA
② 外源基因正接反接都能够转录。
③ MCS与pUC18的完全一样。
11、 穿梭质粒载体的特点和优点有哪些?
特点: 人工构建的、 具有两种不同复制起点和选择标记、 能够在两种不同的寄主细胞中存活和复制的质粒载体。
优点: ① 利用大肠杆菌进行基因克隆、 表示② 也能利用其它细胞系统( 酵母、 枯草杆菌、 哺乳动物细胞等) 进行基因表示。③ 能够自如地在两种不同寄主细胞之间来回转移基因。
12、 什么是质粒的差度?
每个菌体中所拥有的质粒拷贝数不完全相同, 称差度。低拷贝数的质粒的差度小, 遗传稳定。高拷贝数的质粒载体差度大, 拥有少量拷贝数的菌体多, 发生丢失的可能性大。
13、 什么是噬菌体的溶菌周期和溶原周期?
溶菌周期: 烈性噬菌体( virulent phage)感染细菌后立即在菌体内复制和合成蛋白质外壳, 重新组装成噬菌体颗粒, 并导致细菌细胞解体, 释放出大量子代噬菌体。
溶原周期: 温和噬菌体( temperate phage)感染细菌后, 将自己的DNA整合到细菌的染色体DNA中。形成这一过程称为溶源化( lysogenization)。
14、 简述M13 噬菌体的生活周期及其构建策略和构建的技术路线以及M13系列载体的优点和缺点。
生活周期: M13经过雄性细菌的F性须注入其+DNA→
+DNA合成－DNA, 形成RF dsDNA→－DNA转录mRNA、 合成+DNA、 翻译形成噬菌体蛋白→组装成新的噬菌体M13, 挤出寄主细胞
构建策略和构建的技术路线:
( 1) 克隆区域的选定
① 基因间隔区( intergenic region, IG区) M13基因组中只有基因II与基因IV之间存在一段507bp的基因间隔区。
② 酶切位点: IG区内只有一个 BsuI 切点。其余9个BsuI限制性位点分布在其它部位。
（2） 加入酶切位点
① 在IG区内加入单一内切酶位点: 第一个M13载体: M13mp1: 在IG区内插入一个大肠杆菌的LacZ’( a-肽序列)。利用a-肽序列中的三个单一酶切位点( Bgl II、 Ava II 和 Pvu I) 。
（3） M13载体系列: ① M13载体系列的命名: M13mpn n代表系列数字
② 对M13mp1的改进: 加上常见的酶切位点。
③ 对M13mp2的进一步改进: 在M13mp2的LacZ’的5‘端加上一段人工合成的多克隆位点( MCS) 。
优点: ( 1) 有MCS, 便于克隆不同的酶切片段
( 2) Xgal显色反应, 可供直接选择
( 3) 无包装限制, 克隆能力大
( 4) 能够克隆双链DNA分子中的每一条链
缺点: ① 插入外源DNA后, 遗传稳定性显著下降
② 实际克隆能力小于1500bp。

15、 什么是噬菌粒载体? 简述pUC118/pUC119载体的构成、 特点和噬菌粒载体的包装。
噬菌粒载体: 由质粒载体与单链噬菌体载体的复制起点结合而成的新型载体系列。
① 构成: 1) M13的基因间隔区( IG) , 带有M13复制起点。
2) pUC18/pUC19质粒载体: 质粒复制起点Ampr; lacZ’; MCS
② pUC118/119的复制模式: 1) 双链质粒复制模式: 受pUC本身的复制起点( 来源于ColE1) 的控制。
2) 单链滚环噬菌体复制模式: 当寄主细胞被辅助噬菌体M13感染后。来源于M13的复制起点被辅助噬菌体的基因II产物控制。
③ 噬菌粒载体的包装:
1) 辅助噬菌体: 自身的复制起点发生了突变, 复制效率低下, 但感染细菌后能表示出外壳蛋白和复制蛋白, 帮助噬菌粒载体复制。

2) 包装:
16、 pBluescript 噬菌粒载体的特点和常见的pBluescript SK/KS( +/-) 载体如何区分?
特点: 1) 定向体外转录: MCS两侧分别加上T3和T7噬菌体的启动子。加入适当的噬菌体RNA聚合酶, 就能够定向体外转录。
2) 两种复制模式: 既能以质粒的形式复制, 又能以噬菌体的形式复制包装。
3) 选择方便: 有Ampr和lacZ’, 能够进行Amp抗性选择和Xgal-IPTG蓝白斑选择。
4) 插入方便: 18个单一酶切位点的MCS
pBluescript SK/KS( +/-) 区分:

17、 T 载体的特点和优点?
特点: MCS的中部已经切开, 各有一个3’端突出的T。
优点: PCR产物往往在3’端突出一个A, 因此能与这个载体直接连接。
可在真核生物表示外显子捕捉
T vector的克隆过程——简便
18、 什么是噬菌体展示载体?
将外源蛋白( 多肽、 酶、 抗体、 DNA结合蛋白) 结合到噬菌体的外壳蛋白上形成融合蛋白, 表示于噬菌体的外表面。
19、 什么是λ载体的cos位点? 理解λDNA的两种复制模型。
lλDNA两端各有12bp的粘性末端, 粘性末端形成的双链区域称为cos位点。
lλDNA的复制 模型: ( 1) θ型复制: λ噬菌体感染细菌的早期: 双链进行θ型复制。
( 2) 滚环复制 : 感染的晚期: 启动滚环复制机制。形成多联体λDAN分子。
20、 简述λ噬菌体载体的构建构建原理和构建过程以及人工构建的λ噬菌体载体的两种类
型的特点。
( 1) 构建原理: 删除l噬菌体的非必须区, 留出插入空间。
( 2) 构建过程: ①在这个非必须区内制造限制酶切点
②引进某些突变表型, 作为选择标记
③突变某些基因, 使它成为安全载体
④删除λDNA必须区段上常见的限制酶切点
（3） 人工构建的λ噬菌体载体有两种类型:
① 插入型载体( insertion vectors):
1） 免疫功能失活型: 插入位点位于载体合成活性阻遏物区域( cI基因) 内。
2) b-半乳糖苷酶失活型载体: 在λ基因组中引入了LacZ’序列。( 其上含有一个EcoR I 克隆位点) 。
② 替换型载体( substitution vectors): 两个多克隆位点区以反向重复形式分别位于lDNA的非必须区两端。
1) λ EMBL4: λEMBL4的可置换片断内部还有Sal I酶切位点。以便于进一步消化中间片断, 防止自我连接。
2) Charon40: Charon40的可置换片断是由DNA短片重复构成, 片断之间有Hae I 切点。在克隆的时候, 能够用Hae I 酶进一步将可置换片断切成小片断, 以防止重新与载体连接。
21、 为什么λ载体需要体外包装? 简述其体外包装过程
λDNA象质粒载体那样直接转化细菌时效率远比质粒低, 必须利用噬菌体外壳的作用。
体外包装过程: ① λ噬菌体外壳蛋白的合成

22、 什么是cosmid质粒载体? 有何特点?
柯斯质粒是人工建造的的含有λDNA的cos序列和质粒复制子的特殊类型的质粒载体。这是一类用于克隆大片段DNA的载体, 它是由λ噬菌体的cos( cohesive) 末端及质粒( plasmid) 重组而成的载体。
特点: ①具有λ噬菌体的特性: 在寄主细胞内形成环化DNA( 但不能形成新的噬菌体颗粒而溶菌 ) 。克隆外源DNA后能够体外包装成噬菌体颗粒。
②具有质粒载体的特性: 大多带有pMB1或ColE1的复制子, 能象质粒一样复制。
③方便的选择: 有抗菌素抗性基因, 和插入失活的克隆位点。
④高容量的克隆能力: 45kb ( 最少不能低于30kb)
23、 什么是柯斯克隆? 其理论基础是什么? 简述cosmid克隆的一般过程
应用cosmid载体在大肠杆菌中克隆大片端的真核基因组DNA技术, 叫”柯斯克隆”
理论依据: cos位点:: 包装识别。
”多联体”复制: λ噬菌体的生命周期中, 会产生数百个λDNA经过cos位点连接的”多联体”分子。Ter体系: 在包装的时候, λ 噬菌体具有位点特异的末端酶( terminase) 体系( Ter体系) , 识别cos位点, 把多联体切成单个λDNA长度。
包装限制: 两个cos位点之间, 必须保持38—45kb的DNA, Ter体系才能识别。
cosmid克隆的一般过程:
①用特定的核酸内切酶消化真核生物DNA。
②用同样的内切酶消化cosmid载体。
③连接: 产物中将有一定比例的分子是两端各有一个cos位点、 长度40kb左右的真核DNA与载体的连接物。
④ Ter体系识别并切割: 切割合适长度的杂种DNA连接物, 并包装入噬菌体头部。
⑤感染大肠杆菌: 注入到细菌体内的杂种DNA分子环化, 并按质粒的方式复制。
24、 什么是酵母人工染色体载体? 有何特点? 简述YAC载体的组成结构及其转化过程
酵母人工染色体( Yeast artificial chromosomes YACs) YAC 人工染色体载体是利用酿酒酵母( Saccharomyces cerevisiae) 的染色体的复制元件构建的载体, 其工作环境也是在酿酒酵母中。
特点: ( 1) 只能在酵母细胞中扩增。
（2） 克隆容量大, 为230kb-1700kb。
（3） 构建原理, 按染色体结构构建。
YAC的组成结构: ( 1) 着丝粒区( CEN) ( 2) 端粒( TEL) ( 3) 复制起点( ORI) ( 4) 克隆位点( 5) 在酵母中的标记基因( 6) 在细菌中操作
YAC转化过程: ( 1) 宿主酵母菌: trp- 和 ura-
( 2) 选择方式: 只有同时得到YAC的两个臂, 才能在基本培养基( 不加TRP和URA) 上生长。
25、 细菌人工染色体载体? 简述BAC载体的特点和组成结构。
细菌人工染色体( Bacterial artificial chromosome, BAC) 是指一种以F质体( F-plasmid) 为基础建构而成的载体, 最多可保存300000个碱基对( 平均约150000) 。
F质粒的特点: ( 1) 单拷贝复制。( 2) 克隆容量可达300kb。( 3) 比较稳定。( 4) 便于提纯
BAC的组成结构: ( 1) OriS和repE控制质粒的单向复制。
（2） parA和parB维持低水平质粒拷贝数。
（3） CosN是噬菌体末端酶专一性切割位点。
（4） loxP是P1 Cre蛋白作用位点。
（5） HindIII和BamHI是插入位点。
（6） 两侧的NotI可用于切下外源DNA。
（7） 氯霉素抗性基因CMR
26、 简述反转录病毒的基因组结构及反转录病毒载体构建原理及其包装原理
反转录病毒的基因组结构:

反转录病毒载体构建: ( 1) 删除pol、 env和gag基因。

( 2) 插入标记基因( 如neor) 。
( 3) 外源基因和启动子插入到ψ+下游。
反转录病毒载体的包装:
( 1) 包装细胞系的构建: 反转录病毒DNA转化细胞的效率很低, 必须包装成病毒颗粒转染细胞。用两个缺失了ψ+的反转录病毒染色体转化细胞, 以制造病毒外壳蛋白。
( 2) 载体RNA的包装:
①用载体DNA转化包装细胞系转入的载体DNA上带有ψ+, 转录成的载体RNA就会被包装细胞中原有的病毒外壳蛋白识别包装成重组病毒颗粒。
27、 腺病毒作为载体的优点有哪些? 腺病毒载体系统的构成和特点
腺病毒的优点: ( 1) 比较安全, 无致病、 致癌、 致畸作用。
( 2) 宿主范围广, 不但能感染有分裂能力的细胞, 也能感染不能分裂的细胞( 如神经细胞) 。
( 3) 能够在呼吸道和肠道中繁殖, 能够经过口服或喷雾的方式感染。
( 4) 载体中的插入片断可达7.5kb( 有包装容量限制) 。
( 5) 腺病毒容易制备、 纯化。
( 6) 基因组结构和功能了解得清楚。
腺病毒载体的构建:
①删除腺病毒DNA一些非必须区
②构建质粒载体
③把质粒切成线性
④共同转染细胞
特点: ( 1) 以游离的附加体形式存在于细胞中
( 2) E1是腺病毒繁殖的必须区
( 3) E3区对腺病毒的繁殖不是必须的
28、 什么是基因打靶?简述基因打靶载体的要求和组成以及整合方式
基因打靶: 经过DNA同源重组, 使细胞特定的内源基因被破坏而造成其功能丧失或在基因组特定的位点插入外源基因。
基因打靶载体的要求: 1. 要求能整合到染色体上特定的位置。
2. 整合的位置尽量选在基因组内编码非必须产物的地方。
3. 必须整合在基因组中能够转录的区域。
基因打靶载体组成: 1. 两段同源DNA序列( HB1和HB2)
2. 目的基因
3. 编码抗G418的基因( neor)
4. 胸苷激酶基因( HSV-tk1和HSV-tk2)
载体的整合方式: 1. 非特异整合——非同源重组: 两个tk基因至少有一个可能整合到基因组里细胞被tk基因杀死。
2.特异位点整合——同源重组: 只有目的基因和neor基因整合进去, tk基因不会整合。细胞在G418中存活。

第四章 目的基因的获取
1、 什么是目的基因?
准备要分离、 改造、 扩增或表示的基因。
2、 基因组DNA片断化的方法有哪些?
一、 限制性内切酶法:用限制性内切酶把基因组DNA切成不同大小的片断。
二、 随机片断化:
1. 限制性内切酶局部消化法:控制内切酶的用量和消化时间, 使基因组中的酶切位点只有一部分被随机切开。
2. 机械切割法:( 1) 超声波:超声波强烈作用于DNA, 可使其断裂成约300bp的随机片断。
( 2) 高速搅拌:1500转/分下搅拌30min, 可产生约8kb的随机片断。
3、 什么是化学合成目的基因? DNA化学合成有哪些方法? 具体操作过程有哪两种形式?
基因的化学合成也就是以四种核苷酸为原料合成DNA或RNA序列。
常见的方法:磷酸二酯法、 磷酸三酯法、 亚磷酸三酯法、 固相合成法、 自动化合成法。
操作过程: 第一种方法是先将寡聚核苷酸激活, 带上必要的5’-磷酸基团, 然后与相应的互补寡核苷酸片段退火, 形成带有粘性末端的双链寡核苷酸片段, 再用T4DNA连接酶将它们彼此连接成一个完整的基团或基团的一个大片段。
　　第二种方法是将两条具有互补3’末端的长的寡核苷酸片段彼此退火, 所产生的单链DNA作为模板在大肠杆菌DNA聚合酶Klenow片段作用下, 合成出相应的互补链, 所形成的双链DNA片段, 可经处理插入适当的载体上
4、 DNA合成仪是根据哪个原理设计的?
DNA的固相合成。
即DNA3'端固定于基质上, 然后沿3'向5'方向依此添加核苷酸直至合成所需的DNA片段。不同于应用DNA聚合酶的DNA合成。

4、 简述化学合成DNA片断的组装方式
1. 互补连接法:
（1） 互补配对: 预先设计合成的片断之间都有互补区域, 不同片断之间的互补区域能形成有断点的完整双链。
（2） 5’端磷酸化: 用T4多核苷酸激酶使各个片段的5’端带上磷酸
（3） 连接酶连成完整双链
2. 互补延伸连接法: 预先设计的片断之间有局部互补区, 能够相互作为另一个片断延长的引物, 用DNA聚合酶延伸成完整的双链。
5、 寡聚核苷酸化学合成的优点有哪些?
1. 直接合成基因: ( 1) mRNA的含量很低, 很难作cDNA
( 2) 有些基因比较短, 化学合成费用较低
2. 合成引物( 20mer左右)
3. 合成探针序列
4. 定点突变合成
5. 合成人工接头或衔接物
6、 什么是基因文库? 简述构建基因文库过程。
基因文库( gene library) : 将某种生物细胞的整个基因组DNA切割成大小合适的片断, 并将所有这些片断都与适当的载体连接, 引入相应的宿主细胞中保存和扩增。
理论上讲, 这些重组载体上带有了该生物体的全部基因, 称为基因文库。
过程: ( 1) 染色体DNA大片段的制备
断点完全随机, 片断长度合适于载体连接。不能用一般的限制性内切酶消化法。
① 物理切割法: 超声波( 300bp) 或机械搅拌( 8kb) 。
② 酶切法: 内切酶Sau3A进行局部消化。可得到10-30kb的随机片断。
（2） 载体与基因组DNA大片段的连接: 直接连接、 人工接头或同聚物加尾。
① 粘性末端直接连接: 载体与外源DNA大片段的两个末端都有相同的粘性末端。
②人工接头法( ad