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几丁质酶抑制化合物研究进展几丁质酶抑制化合物研究进展
【摘要】 几丁质酶抑制化合物作为一种可开发成具有新型作用靶标的生物农药早已引起国内外生物学家地广泛关注。近年发现几丁质酶抑制剂allosamidin对哮喘病具有一定疗效，为几丁质酶抑制化合物在医学领域的应用奠定了一定的基础。本文就几丁质酶抑制化合物的种类、抑制机制，几丁质酶抑制化合物活性测定方法以及相关研究领域的发展前景等做一综述。
【关键词】 几丁质酶 抑制化合物 抑制机制
Advances in chitinase inhibitors
ABSTRACT As a kind of novel pesticides, chitinase inhibitors have attracted many biologists′ interest. It was discovered that chitinase inhibitor, allosamidin, had certain therapeutic efficacy to asthma, which laid a foundation for chitnase inhibitor application in medical domain. This paper introduces several chitinase inhibitors and their repression mechanism, activity determination methods and looks forward to the development of the related research territory.
KEY WORDS Chitinase; Inhibitor; Repression mechanism
　1 几丁质酶抑制化合物研究概况
几丁质是N乙酰氨基葡萄糖以β1，4键连接起来的生物多聚物，是真菌细胞壁、细胞隔膜、昆虫外骨骼的主要组成成分［1］。与几丁质代谢相关的酶主要有几丁质合成酶和几丁质酶两类，几丁质合成酶负责几丁质的合成，几丁质酶负责几丁质的降解。昆虫蜕皮过程中需要几丁质酶部分降解外骨骼中的几丁质以完成其变态发育过程［2］；真菌出芽生殖过程中也需要几丁质酶降解子母细胞之间的隔以完成其生殖过程［3］。由于几丁质酶在含几丁质生物的生长发育过程中发挥着不可缺少的重要作用，因此以几丁质酶作为靶目标的新型生物杀虫、抗真菌剂(几丁质酶抑制剂)的开发成为关注的新热点。因为这类物质可以通过抑制几丁质酶的活性，阻止昆虫幼虫和蛹蜕皮以及真菌子母细胞的分离而起到杀虫和抗真菌作用。同时由于哺乳动物机体的生命代谢不需要几丁质代谢系统［4］，故以几丁质酶作为靶目标的新型生物农药具有对人、畜无害的优点。
迄今为止，几丁质酶抑制化合物的相关研究大致经历了三个发展阶段：第一阶段是从微生物代谢产物中筛选作为昆虫生长调节剂和抗真菌剂的几丁质酶抑制化合物，并就其对昆虫和真菌生命活动产生的影响进行了深入研究，这个阶段以allosamidin［2］的发现和对其生物合成机制的探讨［4～6］为标志；第二阶段是对几丁质酶抑制剂与几丁质酶之间相互作用进行的结构学研究，这为人工设计几丁质酶抑制剂奠定了坚实的基础，这个阶段对CI4［7］、argadin、argifin［8］与几丁质酶相互作用方式和空间结构的阐明为标志；目前，该领域的研究已经从筛选新的几丁质酶抑制剂发展到建立新的筛选模型和发现已知几丁质酶抑制剂的新功能。Zhu等［9］最近研究发现几丁质酶抑制化合物allosamidin对由IL13介导的Th2炎症反应引起的哮喘病具有明显疗效标志着第三个阶段的到来。
2 几丁质酶抑制化合物的检测方法
检测几丁质酶抑制化合物的方法主要有平板透明圈法［10］和化学方法两种，它们的基本原理都是以缓冲液或蒸馏水作为对照，检测目的物是否能够抑制几丁质酶的活性。
平板透明圈法是在胶体几丁质平板上打孔，然后将等量的几丁质酶分别与蒸馏水(或缓冲液)以及待检测物质水溶液混合，将混合液吸入孔中，观察几丁质被分解的情况。由于几丁质酶能够水解平板基质中的胶体几丁质而产生透明圈，若存在几丁质酶抑制化合物，与对照相比透明圈可变小，甚至不产生透明圈。此法直观、简便，可用于几丁质酶抑制化合物的初筛。
化学方法是基于几丁质酶将几丁质降解后，生成单体或寡聚体的还原性末段能与特定的显色剂发生显色反应，通过测定吸光值的变化计算出几丁质酶的活性。若存在几丁质酶抑制化合物，吸光值与对照相比有显着降低。此法能定量地分析几丁质酶被抑制的状况。常用的化学检测方法有铁氰化钾法［11］、3，5二硝基水杨酸法［12］等。
3 一些主要的几丁质酶抑制化合物及其抑制机制
　糖类几丁质酶抑制化合物
(1)Allosamidin Allosamidin是Sakuda等在筛选新的昆虫生长调节剂过程中，从链霉菌次生代谢产物中分离出的几丁质酶抑制化合物［1］，是由2分子N乙酰基D氨基阿洛糖和1分子氨基环戊醇衍生物构成的拟三糖化合物［13］(图1)，能以竞争性抑制的方式抑制几丁质酶活性。Allosamidin对家蚕几丁质酶［14］、真菌几丁质酶［15］均具有较强 的抑制活性，对Streptomycin griseus、Serratia marcescens［13］及Candida albicans［16］几丁质酶的抑制作用均较微弱。活体实验表明allosamidin能够阻止家蚕和黏虫的蜕皮，导致其死亡［14］，同时还能抑制真菌的裂殖［15］。Allosamidin是一种广谱的几丁质酶抑制化合物，对多种不同来源的几丁质酶都具有一定的抑制活性，但由于allosamidin人工合成难度较大，大量生产成本很高，制约了它在生产上的广泛
图1 Allosamidin (R=CH3)和DMA(R=H)结构应用，这刺激了人们继续筛选更经济、实用的几丁质酶抑制化合物。
(2)Allosamidin的衍生物 在对allosamidin进行深入研究的同时，有人又在allosamidin产生菌的菌丝体中筛选到了对酵母几丁质酶具有强烈抑制作用的化合物demethylallosamidin(DMA)，它能强烈地抑制酵母几丁质酶的活性，影响酵母细胞的分裂［3］。对产生菌代谢途径进行深入研究时发现DMA是allosamidin生物合成中间体［5］。它们在结构上的差别主要在于R基团的不同，allosamidin的R基团为CH3，DMA的R为H原子［3］(图1)。DMA对酵母几丁质酶的抑制活性比allosamidin强，但它们对昆虫几丁质酶几乎具有相同的抑制活性［17］。
1991年Nishimoto等用白念珠菌几丁质酶作为靶标来筛选几丁质酶抑制剂时，在链霉菌SA684菌株的菌丝提取物中又筛选到另外两种allosamidin的衍生物：glucoallosalosamidin A、B［18］，它们对多种来源的几丁质酶同样具有抑制活性。这对设计新型结构的几丁质酶抑制化合物提供了重要的参考。
肽类几丁质酶抑制化合物

(1)CI4 CI4是Izumida等在海洋假单胞菌IZ208中分离出的一种由精氨酸和脯氨酸构成的环二肽几丁质酶抑制化合物［19］(图2)。CI4能够抑制酵母子母细胞的分离，并能阻止人类病原真菌白念珠菌向能够侵染人的形式的转变［20］。与allosamidin相比，CI4对多数几丁质酶抑制作用较低，但由于CI4与几丁质酶相互作用的化学结构比较容易弄清楚，所以CI4是进一步结构优化的非常有用的支架结构［7］。
(2)Argifin和argadin Argifin是Omura等从真菌Gliocladium 0688的培养液中分离出的几丁质酶抑制化合物，Nomega(Nmethylcarbamoyl)LarginylNmethylLphenyalanylβLaspartylβLaspartylDalanyl构成的环五肽的几丁质酶抑制化合物［21］(图3)。Argifin是首先从真菌的代谢产物中发现的几丁质酶抑制化合物，并以依赖剂量的方式抑制几丁质酶的活性，它能通过抑制蟑螂几丁质酶活性阻止蟑螂蜕皮［21］， 对几丁质酶的抑制活性比allosamidin
图2 CI4结构弱，但作为一种在结构上与糖类化合物完全不同的几丁质酶抑制化合物，argifin对抑制机制的深入研究具有非常重要的价值。
Argadin是Arai等在真菌Clonostachys sp. FO7314菌株的代谢产物中分离到的一种新型几丁质酶抑制化合物［22］。Argadin的结构与Argifin非常相似，为NomegaacetylLarginylDprolylhomoserylhistidylL2aminoadipyl构成的环五肽化合物(图4)。Argadin也能通过抑制蟑螂几丁质酶活性，阻止其幼虫蜕皮［21］。结构学研究发现argadin与argifin均与几丁质酶Asp142和Glu144相互作用，这两个氨基酸是18家族几丁质酶催化活性中心非常保守的氨基酸序列。Argadin与酶活性中心的结合比argifin更加紧密，形成的复合物的构象也更为稳定，所以argadin对几丁质酶抑制活性比argifin更强，甚至比allosamidin具有更强的几丁质酶抑制活性［8］。
　　　其它几丁质酶抑制化合物
在对allosamidin深入研究的同时，Nitoda在真菌中发现了一种水溶性大分子几丁质酶抑制化合物［23］；Tabudravu等在海绵中筛选出了psammaplin A［24］；Gustav baajeKolstad等人工设计合成了几丁质酶抑制化合物HM508，并对其与18家族几丁质酶相互作用的晶体结构做了深入研究［25］。目前已筛选出近十种不同来源的几丁质酶抑制化合物，同时，研究人员对它们在生产和生活中的应用也进行了积极的探索。
4 几丁质酶抑制化合物的应用前景
几丁质酶抑制化合物的研究始于日本，之后美、英等国的研究者也对几丁质酶抑制化合物的作用机制做了很多积极的探索，在我国相关领域的研究尚处于起步阶段。由于几丁质酶在含几丁质生物的生长发育过程中发挥着不可缺少的重要作用，因此几丁质酶抑制化合物作为新型生物杀虫、抗真菌剂具有较大的开发前景。最近的研究发现allosamidin对由IL13介导的Th2炎症反应引起的哮喘病具有明显的治疗作用，同时对其信号传导途径做了初步探索［1］。该研究将几丁质酶抑制化合物的研究推到了一个崭新的阶段，为几丁质酶抑制化合物在医学领域的应用打开了大门。随着分子生物学技术的发展和现代医学对某些生命过程的逐步揭示，并对其涉及的关键酶、受体、转录因子、趋化因子及信号传导途径的深入研究，几丁质酶抑制化合物必将在更广泛的领域发挥作用，为人类做出更大的贡献。
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