细胞工程期中全样本.doc

资料内容仅供您学习参考，如有不当或者侵权，请联系改正或者删除。第一篇、 细胞工程的技术基础绪论1、 细胞工程: 是以生物细胞或组织为研究对象, 运用细胞生物学, 分子生物学, 工程学的原理、 试验方法或技术, 在细胞水平上研究改造生物遗传特性和生物学特征, 以获得特定的细胞、 细胞产品或新生物体的有关理论和技术方法的学科。2、 细胞培养、 组织培养( 体外培养) : 是指生物细胞和组织在离体条件下的生长和增殖。3、 细胞核移植: 是利用显微操作技术将细胞核与细胞质分离, 然后再将不同来源的核与质重组, 形成杂合细胞的过程。4、 干细胞: 是动物体内具有分化潜能、 并能自我更新的细胞, 分为胚胎和组织干细胞。5、 单克隆抗体: 是由识别一种抗原决定簇的细胞所产生的均一性抗体第一章、 细胞培养的设施与基本条件1、 培养用器皿: 培养皿、 培养瓶、 培养板。2、 生物安全: 生物技术的研究、 应用以及生物技术产品的研究、 开发、 商品化生产过程中发生的可能危及生物多样性、 环境和人类健康的安全问题。3、 实验室生物安全: 在进行细胞与组织的培养, 特别是含有病原的生物材料的培养时, 保证培养物不受污染及培养物不会对实验人员和环境造成污染的安全问题。第二章、 清洗与消毒1、 消毒方法: 物理灭菌法( 紫外线消毒、 电离辐射消毒、 湿热消毒、 干热消毒、 过滤消毒) ; 化学消毒法( 75%酒精、 甲醛伏和磺酊、 过氧乙酸、 来苏尔) 。第三章、 细胞培养的基本方法1、 细胞周期的时间测定方法: 同位素标记测定法、 流式细胞仪测定法。2、 细胞培养过程中的污染包括: 微生物( 细菌、 真菌、 支原体和病毒) 、 化学物( 影响细胞生存的非细胞所需的化学成分) 、 细胞( 非同种的其它细胞) 。3、 MTT比色法测定细胞活力: ( 色度OD, 活力) ; 细胞活力测定方法: 血球记数板( 人工) 、 流式细胞仪( 自动) 。第二篇、 动物细胞工程第四章、 细胞培养1、 培养细胞的生长特点: 贴附、 接触抑制、 密度抑制。2、 原代培养期( 初代培养期) : 指从体内分离组织接种培养到第一次传代的阶段; 特点: 细胞移动比较活跃, 细胞分裂但不旺盛, 是药物测试很好的对象。传代: 将原代细胞分开至多个新的培养瓶中的过程。 细胞系: 初代培养细胞经过第一次传代后的细胞( 有限细胞系和无限细胞系) 。 特点: 此过程持续时间最长, 细胞增殖旺盛, 维持二倍体核型。3、 细胞株: 从一个经过生物学鉴定的细胞群中筛选出来的单个细胞增殖形成的细胞群, 即经过克隆法得到的细胞群体。 衰退期细胞特点: 细胞依然生长, 但不增殖或增殖很慢, 最后衰退死亡。3、 接触抑制: 由细胞接触而抑制细胞运动的现象; 区别正常细胞与癌细胞的标志之一。5、 细胞周期: 是指一个母细胞分裂结束后形成的细胞至下一个再分裂结束形成两个子细胞的时期; 包括G1期、 S期、 G2期和M期。6、 培养基营养成分: 氨基酸、 单糖、 维生素、 其它成分。7、 天然培养基包括: 生物性液体( 如血清) 、 组织浸液( 如胚胎浸液) 、 凝固剂( 如血浆等) ; 8、 合成培养基: 是在研究和了解细胞所需成分基础上, 经过人工设计, 配置而成的培养基。9、 无血清培养基: 指不需添加血清就可维持细胞在体外较长时间生长繁殖的合成培养基。无血清培养基包括: 基础培养液、 添加组分两大部分。无血清培养基的优点: 供应充分, 货源充分; 产品成分简单, 易于纯化; 提高了细胞培养的可重复性; 减少了血清中蛋白对某些生物测定的干扰。避免了血清批次对实验的影响; 避免了血清中带有的菌或毒素对细胞培养的毒性作用; 意义: 虽然血清能够提供细胞增殖生长的生长因子促进DNA的合成, 从而促进细胞增殖, 但其成分十分复杂, 在许多基础理论研究中若使用血清培养基, 肯能带来错误的实验结果, 特别是血清中含有一定数量的毒素和抑制剂以及对细胞有去分化作用的成分, 影响细胞功能的表示, 因此, 许多实验研究, 比如生长因子实验、 单克隆抗体制备、 细胞分泌物的实验都要利用无血清培养基。10、 原代培养( 初代培养) : 是从体内分离组织接种到第一代传代的这个阶段; 11、 防止凝血用肝素、 柠檬酸钠。12、 分散组织的方法: 机械法( 离心法、 切割法、 机械分散法) ; 消化法( 胰蛋白酶消化法、 胶原酶消化法、 螯合剂消化法) 。13、 细胞培养方法: 组织块培养方法、 单层细胞培养、 悬浮细胞培养。14、 克隆培养法: 又称作单细胞分离培养法, 就是将从细胞悬液中获得的单个细胞用于培养, 使之重新繁衍成一个新的细胞群体的培养技术。15、 饲养细胞: 为了促使刚刚克隆化的极少量细胞生长、 繁殖, 在培养皿中加入能贴壁生长的其它细胞。16、 单克隆抗体技术: 把能够产生单一抗体的淋巴细胞和具有无限繁殖能力的骨髓瘤细胞在体外融合成杂交瘤细胞, 能无限增殖而且产生抗体, 经过体外体内培养用于生产单克隆抗体的技术。第五章、 细胞融合与单克隆抗体1、 细胞融合: 是指在离体条件下用人工方法将不同种生物或同种生物不同类型的单细胞经过无性方式融合成一个杂合细胞的技术。2、 多克隆抗体: 由同一抗原诱导而产生的针对多个抗原决定簇的抗体。3、 生物导弹: 单克隆抗体与抗癌药物或毒素合成。4、 单克隆抗体的特点: 高度的特异性; 高度的稳定性; 高抗体活性; 单一性。5、 杂交瘤细胞制备: 用抗原免疫小鼠免疫脾细胞 在PEG作用下融合成杂交瘤细胞选择培养( HAT) 骨髓瘤细胞的培养骨髓瘤细胞 阳性克隆的筛选及克隆化未融合的细胞死亡, 杂交瘤细胞存活 克隆扩增及大量制备McAb6、 筛选杂交瘤的方法: 第二抗体法、 抗原结合法、 功能筛选法。第六章、 胚胎工程1、 体外受精: 是指哺乳动物的精子和卵子在体外人工控制的环境中完成受精过程的技术。2、 超数排卵: 是指人为注射外源促进性腺激素, 促使卵巢排出较正常情况下更多的成熟卵子。常见的方法是: 利用孕马血清促性腺激素。3、 发育阻滞: 是指体外受精的早期胚胎在发育过程中, 常常发生停滞在某一阶段不再发育的现象; 原因: 与胚胎的母源基因调控向自身基因调控的转换有关; 胚胎基因的激活使细胞内H2O2浓度升高, 体外培养环境下不能被及时清除, 不断积累, 造成细胞中毒, 从而使胚胎发育阻滞。克服方法: 改进培养液成分, 改进培养条件, 尽量满足早期胚胎发育所需物质, 确定并减除对其发育不利的成分; 利用体细胞共同培养体系, 以提供发育所需 的物质条件。4、 胚胎移植( 受精卵移植) : 是指将良种母畜配种后, 从其生殖道取出受精卵或早期胚胎, 移植到同种生理状态相同的母畜体内, 使之继续发展成为新个体技术。5、 胚胎分割技术: 是将一枚胚胎用显微手术的方法分割成二分、 四分甚至八分胚, 经体内或体外培养, 然后移植入受体中, 以得到同卵双生或同卵多生后代的技术。理论基础: 动物细胞胚胎具有全能性。6、 性别控制的意义: 临床上的应用利用早期胚胎性别鉴定, 可用于性别关联遗传疾病的诊断, 防止疾病发生; 畜牧业的应用从受性别限制的性状或受性别影响的性状方面获益, 如母畜产奶、 公畜产肉等; 消灭不理想的隐性性状, 防止性连锁疾病的发生; 预测和控制家畜的遗传和表型性别, 可增加选育强度, 加速遗传进展和畜群更新; 性别控制与胚胎移植、 核移植等技术的应用, 可加速濒危动物、 珍稀动物的繁殖和保种; 充分发挥种母畜的繁殖潜力, 提高母畜的繁殖效率, 进而提高畜牧业的经济效益; 性别控制也是体外受精、 核移植单精注射及转基因动物的一项配套技术, 它的应用必将促进其它生物技术的发展。 性别控制的问题: 破坏了自然法则下原有的生物性别比例; 加快了生物繁殖速度, 给地球有限资源带来负担; 可能发生近亲繁殖现象, 不但阻遏了生物的进化和多样性, 也违背了社会伦理道德。第七章、 干细胞与组织工程1、 ES细胞: 从细胞团中分离出来, 在一定培养条件下可在体外”无限期”地增殖传代, 同时还保持其全能性的细胞。ES细胞的特征: 、 衍生自囊胚的内细胞团或原始外胚层的细胞; 、 永生化; 、 能维持稳定和的正常的二倍体染色体结构; 、 有稳定的发育潜能, 能背诱导增殖或分化; 、 能参与胎儿所有组织的发育过程。2、 ES细胞的研究意义: 人胚胎发育机制及影响因素的研究; 用于药物机理及毒性实验的研究, 减少人体和动物的实验及临床研究; 将胚胎干细胞定向分化的细胞用于制造人体细胞, 组织和器官; 动物克隆及人类治疗性克隆。( 3、 4为培养的最大目的。) ES细胞研究面临的难题: 用于干细胞研究的胚胎来源困难; 如何保持胚胎干细胞的细胞全能性, 并控制向特别类型细胞转化; 如何分离纯化干细胞; 分化后的细胞是否有致瘤性; 干细胞在体外发育成完整的器官尚且难以做到; 分化细胞移植仍有可能发生免疫排斥; 伦理问题。第八章、 核移植技术与动物克隆1、 克隆: 克隆是指生物体经过体细胞进行的无性繁殖, 以及由无性繁殖形成的基因型完全相同的后代个体组成的种群。第九章、 转基因动物与动物生物反应器1、 培育转基因动物的方法: 基因显微注射法、 逆转录病毒感染法、 胚胎干细胞介导法、 精子载体导入法、 YAC介导的基因转移、 细胞核移植技术。2、 转基因动物整合方式分为: 基因随机插入、 基因剔除( knock out) 、 基因替换( knock in) 。基因打靶: 经过DNA定点同源重组, 改变基因组中的某一特定基因, 从而在生物活体内研究此基因的功能; 基因敲入: 某个特定基因定点插入在个体的基因组中或取代基因组中某个片段, 并使之表示, 研究该基因在体内的功能; 基因敲除: 使基因组中的某个基因产生缺陷, 而丧失正常的功能, 来推测此基因原来在体内的功能。3、 生物反应器: 是利用酶或生物体所具有的生物功能, 在体外进行生化反应的装置系统; 第十章、 动物染色体工程1、 染色体加倍技术有: 化学诱导方法秋水仙素、 细胞松弛素; 物理学方法温度休克法、 水静压法; 生物学方法。2、 人工染色体: 要3个关键序列自主复制DNA序列、 着丝粒DNA序列、 端粒DNA序列。细胞工程( 植物部分期中考之后) 第十一章1 植物细胞的全能性: 是指植物体的每一部分组织或器官在一定的条件下都具有发展成完整植株的潜在能力。2 细胞分化: 细胞分裂过程中, 细胞后代在形态结构和功能上发生差异的过程。3 脱分化: 在组织培养时, 放在一定的培养基上后, 已分化的细胞重新进入分裂状态。一个成熟的细胞转变为分生状态的过程。4 再分化: 一个成熟的植物细胞经历了脱分化后, 能再分化而形成完整植株的过程。5 愈伤组织: 原指植物在受伤之后于伤口表面形成的一团薄壁细胞; 在组培养中则指人工培养基上由外植体长出来的一团无序生长的, 无组织结构、 松散的细胞团。 6 影响植物组织培养的因素: 内在因素: 外植体的选择不同的遗传背景会有不同培养结果; 外植体的生理状况: 生理状态年轻, 来源于生长活跃或生长潜力大的组织和器官的细胞更有利于培养; 营养条件: 激素、 有机、 无机成分等; 外在因素: 环境条件光照、 温度、 湿度、 PH、 振荡频率、 培养基的选择、 选择合适的前体物质等。7 悬浮培养: 是指将单个游离细胞或小细胞团在液体培养基中进行培养增殖的技术。悬浮培养体系的建立: ( 1) 、 材料: 愈伤组织、 外植体幼苗、 胚轴、 子叶。( 2) 、 筛选悬浮培养物: 成功的悬浮细胞培养体系必须满足三个条件: 悬浮培养物分散性良好, 细胞团较小, 一般在3050个细胞以下; 均一性好, 细胞形状和细胞团大小大致相同; 细胞生长迅速, 悬浮细胞的生长量一般23天甚至更短时间便可增加一倍。 筛选方法 愈伤组织外观为大小均一的小颗粒, 疏松易碎、 外观湿润, 细胞色泽呈鲜艳的乳白或淡黄色。 挑出愈伤组织于高有机质、 高激素、 低糖的培养基中培养, 诱导出更多愈伤组织。 悬浮培养 挑选的愈伤组织在液体培养基、 120r/min、 25 、 弱光下培养; 23d, 依次用500um、 100um的尼龙膜过滤均匀的悬浮体系培养物。( 3) 、 悬浮培养物的继代培养 转移的材料的量以在120r/min条件下悬浮起为宜。 培养基的更换: 旧培养基约为新培养基的1/3。8 植物培养的应用: 植物的快速繁殖、 体外单倍体诱导与单倍体育种、 植物胚胎培养、 体细胞胚胎发生和人工种子、 植物原生质融合技术、 植物染色体工程、 植物转基因技术。次生物的工业化生产。9 生长素类: 在组培中用于诱导细胞的分裂和根的分化。常见的有IAA(吲哆乙酸)、 NAA (奈乙酸 )、 2,4-D(二氯苯氧乙酸)和IBA(吲哆丁酸)等。10 植物细胞大规模培养技术的特点: 、 培养的细胞在遗传上应是稳定的, 以得到产量恒定的产物; 、 细胞生长及生物合成的速度快, 在较短的时间内能得到较高产量的终产物; 、 代谢产物要在细胞中积累而不被迅速分解, 最好能将其释放到培养基中。第十二章1 植物快速繁殖技术: 利用组织培养技术, 将优良植株的茎尖、 腋芽、 叶片、 鳞片等器官、 组织进行离体培养, 在短时间内获得大量遗传性状一致的植株的技术。2 怎样生产无毒菌及常见的检测方法: 生产无毒菌的方法有微茎尖培养法: 解剖镜下用锋利解剖刀迅速准确地剥离带有12叶原基生长点的芽尖。热处理法: 根据病毒与寄生细胞对高温的忍耐程度不同, 选择适当的温度和处理时间, 植物组织中的很多病毒被部分地或完全地钝化从而可控制其活动, 但很少伤害甚至不伤害寄主组织, 从而让植物细胞加快生长, 使生长点附近不带病毒, 从而达到脱毒的目的。抗病毒药剂法: 运用一些抗病药剂的作用影响病毒的复制形成, 干扰病毒的正常生长, 从而达到除去病毒的目的。珠心组织培养法: 利用无维管体系的珠心组织为材料, 培养获得无毒植株。检测方法: 1 植株直接测定法2 指示植物法3、 血清学方法。微茎尖培养法的植物脱毒的原理: 病毒在植物体内的分布具有不均匀性。感染病毒植株的体内病毒的分布并不均匀, 病毒的数量随植株部位及年龄而异, 越靠近茎顶端区域的病毒的感染深度越低, 生长点则几乎不含或含病毒很少。这是因为分生区域内无维管束, 病毒只能经过胞间连丝传递, 赶不上细胞不断分裂和活跃的生长速度。第十三章1 单倍体植株的产生方法: 诱导孤雌生殖法、 半配合法、 染色体消除法、 花药和花粉的培养法。2 经过离体培养获得单倍体的途径有哪些: 花药花粉培养、 未受精子房、 胚珠培养、 裸子植物的培养。3 单倍体育种有什么意义? 答: 获得纯系育种材料和进行单倍体育种, 利用杂种优势缩短育种年限、 提高育种效率。由单倍体获得的纯合二倍体能够用于遗传变异规律研究以及基因定位、 性状分子标记和基因克隆。克服远缘杂交后代性状分离严重、 很难稳定的问题, 经过单倍体的利用获得稳定的远缘杂种后代。单倍体诱发突变单倍体只存在一套染色体, 不存在对应的等位基因, 因此一旦发生基因突变, 植株的性状就会发生变化, 这非常有利于隐形突变体的筛选。在转基因技术中, 单倍体细胞用作受体, 然后加倍成为二倍体, 能够获得稳定的转基因植物, 避免外源基因在转基因植物后代中的分离和丢失。花药和花粉培养也用于研究减数分裂和小孢子发育规律。4 花粉花药的培养有什么差异, 影响因素。答: 一、 从概念来看, 花药离体培养是把花粉发育到一定阶段的花药接种到培养基上, 来改变花药内花粉粒的发育程序, 使其分裂形成细胞团, 进而分化成胚状体, 形成愈伤组织, 由愈伤组织再分化成植株。二、 从培养层次来看, 花药离体培养属器官培养, 花粉离体培养属细胞培养, 但花药离体培养和花粉离体培养的目的一样, 都是要诱导花粉细胞发育成单倍体细胞, 最后发育成单倍体植株。三、 从培养过程来看, 花药离体培养相对较容易, 技术比较成熟, 但最后需要对培养成的植株进行染色体倍数检测; 花粉离体培养尽管不受花药壁、 药隔等二倍体细胞的干扰, 但这种特殊单倍体细胞的培养技术难度较大, 当前只在少数植物上获得成功。影响因素: 供体的基因型; 供体植株的生理状况: 开花早期、 长势好、 长期氮饥饿、 高海拔、 高纬度情况下花粉的培养成功率高; 花粉的发育时期: 多数植物单核中、 晚期花粉最易诱导; 材料的预处理和预培养; 培养基; 培养方式; 培养条件: 主要是温度和光照, 大部分先在30以上高温培养一段时间, 再转移至常温培养; 花粉植株的移栽。5 花粉离体培养: 是指把花粉从花药中分离出来, 以单个花粉粒作为外植体进行离体培养的技术, 由于花粉已是单倍体细胞, 诱发它经愈伤组织或胚状体发育而成的植株都是单倍体, 且不受花药的药隔、 药壁、 花丝等体细胞的干扰。第十四章1 植物胚胎培养: 是指植物的种胚及胚器官( 子房、 胚珠) 等进行离体无菌培养, 使其发育成幼苗的过程胚培养、 胚珠培养、 子房培养和胚乳培养。2 植物胚胎培养的意义和应用价值: 答: 克服杂交育种中杂种胚的早期夭折; 成熟胚培养快速繁殖。理论研究领域的应用。克服种子休眠、 提早结实, 缩短育种年限提高育种效率。提高萌发效率, 使无生活力的种子萌发。胚培养物作为转基因受体的材料。第十五章1 人工种子: 是指植物离体培养中产生的胚状体包裹在含有养分和具有保护功能的物质中, 并在适宜条件下能够发芽出苗的颗粒体。 2 人工种子由什么组成、 结构、 有什么优点? 人工种子的结构: 体细胞胚由组织培养中获得的体细胞。 人工种皮有防止机械损伤及水分干燥等保护作用。 人工胚乳一般由含有供应胚状体养分的胶囊组成,养分包括矿质元素、 维生素、 碳源以及激素等。 人工种子的优点: 、 人工种子繁殖速度快; 、 缩短育种周期、 加速良种繁育速度; 、 可获得整齐一致的植物苗, 利于农业生产的规范化、 标准化和机械化管理; 、 人工种子的胚乳和种皮, 构成了体细胞胚胶囊。在胶囊中可根据不同植物的需要配制最优的营养, 还可加入某些农药、 微生物、 除草剂等防止病害、 杂草发生; 、 人工种子便于贮藏和运输, 适合机械化播种; 、 可生产不育植株的人工种子; 、 与田间生产相比较, 不受季节的限制, 且节约用地。第十六章1 原生质体: 指除去细胞壁的细胞或是说一个被质膜所包围的裸露细胞。2 原生质体杂交的目的: 、 再生植株; 、 用于远缘体细胞融合, 进行体细胞杂交; 、 克服种、 属以上植物有性杂交不亲和性障碍。 3 原生质体的分离方法: 机械分离法、 酶解分离法( 纤维素酶、 半纤维素酶、 果胶酶、 蜗牛酶、 R10等) 。4 原生质体活力检测: 目测法: 在显微镜下观察, 根据细胞形态、 流动性确定原生质体活力。FDA法: FDA是一种非极性物质, 能自由地穿越细胞质膜, 在活细胞内, FDA被酯酶裂解即发荧光, 死细胞内无荧光现象。伊凡蓝法: 伊凡蓝不能穿过质膜, 只有质膜受到严重损坏使, 细胞才能被染色, 因而能够经过细胞被染色与否确定活性。原生质体的融合方法有: 盐类融合法、 高Ca+&高PH融合法、 聚乙二醇融合法、 高Ca+,高PH和聚乙二醇相结合融合法、 电融合法。5 聚乙二醇融合法的基本原理: 由于PEG分子中醚键的存在使其分子具有微弱的负极性, 能与水、 蛋白质、 糖等极性物质的正极形成氢键, 从而在相邻原生质体表面间作为分子桥, 直接或间接地经过钙而起作用; 当PEG分子被洗脱时, 可能由于电荷紊乱和再分布, 或使膜表面局部脱水, 或改变构型使类脂”液态”化而引起融合。第十七章1 染色体工程: 按设计有计划削减、 添加和代换同种或异种染色体的方法和技术。2 染色体加倍的方法有: 化学诱导方法( 用秋水仙素或细胞松弛素B、 富民农等) 、 生物学方法( 远缘杂交技术、 体细胞杂交技术) 。3 用秋水仙素抑制纺锤体加倍的作用原理: 当细胞进行分裂时, 一方面能使染色体的着丝点延迟分裂, 于是已复制的染色体两条单体分离, 而着丝点仍连在一起, 形成”X”形染色体图象( 称为C-有丝分裂, 即秋水仙效应有丝分裂) ; 另一方面是引起分裂中期的纺锤丝断裂, 或抑制纺锤体的形成, 结果到分裂后期染色体不能移向两极, 而重组成一个双倍性的细胞核。这时候, 细胞加大而不分裂, 或者分裂成一个无细胞核的子细胞和一个有双倍性细胞核的子细胞。经过一个时期以后, 这种染色体数目加倍了的细胞再分裂增长时, 就构成了双倍性的细胞和组织。4 如何离体培养获得单倍体植株? 5 在实际操作中如何确定胚囊的发育时期? 注: 前三章非重点, 多数不考。