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发酵豆粕常见指标检测方法

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2020年4月19日
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粗 蛋 白 含 量 检 测
(GB/T6432)
一、原理：
凯氏法测定样中的含氮量、即在催化剂作用下，用硫酸破坏有机物，使含氮物转化成硫酸铵。加入强碱进行蒸馏使氨逸出，用硼酸吸收后，再用酸滴定，测出氮含量，将结果乘以换算系数6.25，计算出粗蛋白含量。
二、仪器设备：
1. 高速粉碎机，粉碎时间1分钟。
2. 分样筛； 0.45mm、40目
3. 分析天平；感量0.0001g
4. 消化炉
5. 滴定管；酸式50mL
6. 锥形瓶；250mL
7. 定氮仪；以凯氏原理制造的半自动蛋白测定仪
三、试剂
1. 硫酸：含量98%
2. 氢氧化钠：40%水溶液（m/V）
3. 硼酸：2%水溶液（m/V）
4. 混合催化剂：0.4g硫酸铜(5个结晶水)，6g硫酸钾或硫酸钠，磨碎混匀。
5. 混合指示剂：甲基红0.1%乙醇溶液，溴甲酚绿0.5%乙醇溶液，两溶液等体积混合，在阴凉处保存期为三个月。
6. 0.1mol/L盐酸标准溶液：8.3 mL盐酸注入1000 mL蒸馏水中。
标定：减量法称取0.8g左右在270-300℃灼烧2h的无水NaCO3，加水50mL溶解，加10滴混合指示剂，用配好的盐酸滴定成暗红色，煮沸2min，冷却(水中)后再滴至暗红色，同时作空白试验(不加Na2C03)。
计算：
C=
m×1000
(V1-V2)M
式中: C——硫代硫酸钠标准溶液之物质的量浓度（mol/L）
m——无水碳酸钠的质量，g
V1 ——盐酸溶液的用量，mL
V2——空白试验盐酸溶液的用量，mL
M——无水碳酸钠的摩尔质量数值，单位为克每摩尔（g/mol）〔M(1/2NaCO3)=52.994〕
7. 蔗糖
8. 硫酸铵：分析纯，干燥
四、分析步骤：（国标推荐法）
1. 试样的消煮
2. 称取试0.5g（含氮量5～80mg）准确至0.0002g，放入消化管中，加入6.4g混合催化剂，与试样混合均匀，再加入12mL硫酸，于420℃消化炉中消化3小时。冷却后，加入蒸馏水20ml，待用。
3. 氨的蒸馏；
采用半自动定氮仪，将带消化液的消化管插在蒸馏装置上，以25mL硼酸为吸收液，加入2-3滴混合指示剂，蒸馏装置的冷凝管末端要浸入装有吸收液的锥形瓶内，然后向消化管中加入氢氧化钠溶液，以溶液变黑为宜，即当生成黑色的氢氧化铜时，加碱量已够。若加碱量不足或过量，分解液呈蓝色而不显黑色，若加碱不够，需再增加氢氧化钠用量，直到分解液呈黑色为止。蒸馏，蒸馏时间以吸收液体积达到150mL以上时为宜，降下锥形瓶，用蒸馏水冲洗冷凝管末端，洗液均需流入锥形瓶内。
4. 滴定：用0.1mol/L的标准盐酸溶液滴定吸收液，溶液由蓝绿色变淡紫色为终点。
5. 空白测定：
称取蔗糖0.5g，代替试样，按以上分析步骤进行测定，消耗0.1mol/L的标准盐酸溶液的体积不得超过0.2mL，消耗0.02mol/L的标准盐酸溶液的体积不得超过0.3mL。
五、计算：

式中：V1——滴定试样时所需标准酸溶液体积，mL
V0——滴定空白时所需标准酸溶液体积，mL
CHCL——盐酸标准溶液浓度，mol/L
m——试样质量，g
0.014——每毫克当量氮的克数
6.25——氮换算成蛋白质的平均系数
水 分 检 测
(GB/T6435— )
一、适用范围：
本标准适用于配合饲料、浓缩饲料和各种单一饲料中水分的测定，但用作饲料的奶制品、动物和植物油脂、矿物质除外。
二、原理：
试样在105℃烘箱内，在大气压下烘干，直至恒重，逸失的重量为水分。
三、试剂和仪器设备：
1．高速粉碎机，粉碎时间1分钟。
2．分析筛 孔径0.25mm（60目）。
3．分析天平 感量0.0001g
4．电热恒温箱（烘箱） 可控制温度在105±2℃
5．称样皿 玻璃或铝质,直径40mm以上,高25mm以下
6．干燥器 以氯化钙或变色硅胶为干燥剂
四、试样的选取和制备
选取具有代表性的试样，其原始样量应在1000g以上，用四分法缩减至500g，风干后粉碎至全部经过40目筛，再用四分法缩减至200g，装于密封容器中，防止试样成分的变化或变质。
如试样为多汁的鲜样，或无法粉碎时，应预先干燥处理，称取试样200～300g，在105℃烘箱中烘15min，立即降至65℃，烘干5～6h。取出后，在室内空气中冷却4h，称重，即得风干试样。
分析步骤：
1. 洁净称样皿，在103℃烘箱内烘1h，取出，在干燥器中冷却30min，称准至0.0002g，再烘干30min，同样冷却，称重，直至两次重量之差小于0.0005g为恒重。
2. 用已恒重称样皿称取两份平行试样每份2～2.5g（含水重0.1g以上，样品厚度4mm以下）。准确至0.0002g，不盖称样皿盖，在105℃烘箱内烘3.5h，取出，盖好称样 皿盖，在干燥器中冷却30min，称重。
五、计算
水分含量（%）按下式计算：
水分（%）＝
W1－W2
×100%
W1－W0

式中：W1——105℃烘干前试样及称样皿重，g
W2——105℃烘干后试样及称样皿重，g
W0——已恒重的称样皿重，g

粗 灰 分 检 测
(GB/T6438)

一、原理：
饲料样品在550℃灼烧后所得残渣，用质量百分率表示。残渣中主要是氧化物、盐类等矿物质，也包括混入饲料中的砂石、土等，故称粗灰分。
二、仪器设备：
1. 高速粉碎机：粉碎时间1分钟。
2. 分样筛：孔径0.25mm（60目）
3. 分析天平：感量0.0001g
4. 高温炉：有高温计且可控制炉温在550±20℃
5. 坩埚：瓷质，容积50mL
6. 干燥器：用氯化钙（干燥试剂）或变色硅胶作干燥剂
三、试样的选取和制备：
选取具有代表性的试样用四分法缩减至200g，粉碎后全部经过40目筛，装于密封容器中，防止试样成分的变化或变质。
四、分析步骤：
将干净坩埚放入高温炉，在550±2℃下灼烧30min。取出，在空气中冷却约1min，放入干燥器冷却30min，称其质量。再重复灼烧、冷却、称量，直至两次质量之差小于0.0005g为恒质。
在恒质的坩埚中称取2～2.5g试料（灰分质量在0.05g以上），准确至0.0002g，在电炉中碳化至无烟状态(夏季和冬季，可适当延长时间20min)，于550±20℃下灼烧3.5h至灰白色，冷却到200℃。取出，在空气中冷却约1min，放入干燥器中冷却至室温，称取质量。
五、计算：
粗灰分含量（%）按下式计算：
粗灰分（%）＝
m2－m0
×100
m1－m0
式中：m2——为灰化后坩埚加灰分的的质量，g
m1——为坩埚加试料的质量，g
m0——为恒质空坩埚，g
所得结果应表示至0.01%
酸溶蛋白（肽）含量的测定
（据QB/T 2653- 制定）

一、原理
大分子蛋白质和肽链较长的多肽用三氯醋酸溶液进行沉淀，并将其中的短链小肽用酸溶解出来，其中包括小肽和部分α-氨基酸。然后经离心、过滤、消化、蒸馏，测定其蛋白质含量即酸溶蛋白。
二、试剂及仪器
100ml烧杯、10ml和25ml移液管、半微量粗蛋白质测定试剂和装置、40目标准筛、15％三氯醋酸溶液（TCA溶液）、4500 转/ 分钟的离心机、定性滤纸等。
三、试验方法
（1）准确称取样品4.0000g样品，加入15%TCA溶液20ml，混合均匀，静置5分钟。用定性滤纸过滤，取滤液约5ml，4500转/分钟离心10分钟，取上清液4ml注入干燥的消化管中，加入硫酸铜0.2g，硫酸钠3g，再加浓硫酸10ml，消化方法及蒸馏方法与蛋白的测定方法相同。
（2）计算公式：
肽绝对含量（）
——样品中肽含量（%）
——标准盐酸摩尔/当量浓度
V1——样品消耗盐酸体积
V0——试剂空白消耗盐酸体积
m——样品重量（精确到0.0001）
N——为微量法测定粗蛋白时的稀释倍数，若全量法测定则为1
肽相对含量（%） X0——样品中的粗蛋白含量

不 良 寡 糖 定 性 检 测（薄层层析法）
一、原理
薄层层析是以涂布于玻板或涤纶片等载体上的基质为固定相，以液体为流动相的一种层析方法。一般层析操作包括薄板活化、点样、展层、显色和结果分析等步骤。
二、试剂配制（注意：须在通风橱中进行）
1、展层剂
正丁醇：异丙醇：乙酸：蒸馏水=14：10：4（8）：8 (如有拖尾现象，可适当加大乙酸的量)
展层剂混匀后倒入展层缸。
2、显色剂
苯胺1ml，二苯胺1g，浓磷酸5ml，丙酮50ml
先将二苯胺溶于丙酮中，最后加浓磷酸。因为二苯胺不溶于水。
显色剂避光保存，有毒，小心操作。
三、操作步骤
1、样品处理：称取5g试样溶于40mL蒸馏水，于70℃水浴1h。
2、离心（8000rpm，20min）取上清，放入4℃冰箱保存。
3、硅胶板的活化：将硅胶板置于烘箱中，110℃活化1h备用。
4、点样，用水苏糖、棉籽糖和蔗糖做标准（5mg/mL）。
配制方法：称取5mg的水苏糖或棉籽糖、蔗糖，加入1mL蒸馏水。
在硅胶板底部留两厘米，用铅笔划一直线，隔开间距画上点样孔，用毛细管点样，干了再点第二次，干透后展层。（注意：点样时若发现上清已变浑浊，则必须重新离心。）
6、展层：将点好样的薄层板放入预先饱和的展层装置内，让点样一端浸入展层剂中，其深度约0.5cm（切记：样品点不能浸入展层剂中）。当展层剂上升到离硅胶板的顶端0.5-1.0cm时，停止展层，迅速吹干。
7、显色：将显色剂喷雾，95℃烘箱显色6min。
8、拍照：关闭闪光灯，微距拍摄。

挥 发 性 盐 基 氮 检 测
(GB/T 5009.45— )
一、原理：
由于酶和细菌的作用，样品腐败过程中，使蛋白质分解而产生氨以及胺类等碱性物质。此类物质具有挥发性，在碱性溶液蒸出后，用标准酸溶液滴定计算含量。
二、试剂和仪器设备：
1．盐酸溶液（0.01mol/L）：取测蛋白用的0.1mol/L盐酸溶液100.0mL于1000mL溶量瓶中，加水定容至刻度。
2．氧化镁混悬液（10g/L）：称取1.0克氧化镁，加100mL水，振摇成混悬液。
3．指示剂：甲基红乙醇指示剂（2g/L），次甲基蓝指示剂(1g/L)。
4．硼酸吸收液（20g/L），可用蛋白测定用的硼酸吸收液
5．半微量定氮仪
三、分析步骤：
称取10克试样（准确至0.0001g）于碘量瓶中，加100.0mL水，放入振荡器中振荡30分钟，再倒入离心机中离心5-10分钟。取上清液倒入锥形瓶中。上清液置冰箱中备用。
蒸馏滴定：将盛有20mL吸收液及5-6滴混合指示液的锥形瓶置于冷凝管下端，并使其下端插入吸收液的液面下，准确吸取10.0mL上述离心清液于蒸馏器反应室内，加10mL氧化镁混悬液，迅速盖塞，并加水以防漏气，通入蒸气，进行蒸馏5分钟即停止，吸收液用盐酸标液滴定，至终点蓝紫色，同时做试剂空白试验。
四、计算：

X（mg/100g ）＝
（V－V0）×14×C×10
×100
m

式中：
X—试样中挥发性盐基氮的含量，单位为毫克每百克(mg/100g)
V—测定用样液消耗盐酸溶液体积，单位为毫升（mL）：
V0—试剂空白消耗盐酸溶液体积，单位为毫升（mL）：
C—盐酸标准溶液的实际浓度，单位为摩尔每升（mol/L）：
14—与1.00mL盐酸标准滴定溶液﹛C(HCl)=1.000mol/L﹜相当的氮的质量，单位为毫克（mg）
m—试样质量，单位为克（g）。
计算结果保留三位有效数字。

蛋 白 溶 解 度 检 测
(GB/T19541— )
一、方法原理
氢氧化钾蛋白溶解度能够反映大豆粕加热过度的情况，不同加热程度的大豆粕，氢氧化钾蛋白溶解度不同。先测定大豆粕样品在规定的条件下，可溶于氢氧化钾溶液中的粗蛋白质含量；再测定同一大豆粕样品中总的粕蛋白质含量，计算出氢氧化钾蛋白质溶解度。
二、试剂
1．0.2%氢氧化钾溶液，相当于0.04N，pH=12.5(2.44gKOH配成1L)
2． 凯氏定氮所需的标准试剂
三、仪器
1. 高速粉碎机，粉碎时间1分钟。
2. 样品筛：孔径0.25mm
3. 磁力搅拌器
4. 离心机:转速为2700r/min以上
四、试样的选取和制备
取具有代表性的大豆粕样品，用四分法缩减至200g，粉碎后全部经过0.25 mm孔径的样品筛，充分混匀，装于密封容器中备用。
五、操作步骤
称取大豆粕试样1.0克，精确到0.1mg，置于250mL高型烧杯中，加入50.00mL 0.2% KOH溶液，在磁力搅拌器上搅拌20分钟，将溶液转移至离心管中，以2700转的速度离心10分钟后，小心移取上清液10.00mL，放入消化管中,用测定粗蛋白的方法进行测定，将该结果除以粗蛋白结果即为蛋白溶解度。
六、计算
氢氧化钾蛋白质溶解度X,数值以质量分数表示，按下式计算
X=
W1
×100
W2
式中： W1——大豆粕试样溶于氢氧化钾溶液中的粗蛋白质含量；%
W2——大豆粕试样总的粗蛋白质含量（以平均结果来计算）；%
计算结果表示到小数点后一位。