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专题73-制备和应用固相化酶

专题73 制备和应用固相化酶
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【基础回顾】

考点一、固定化细胞技术的概念
　　固定化酶和固定化细胞技术是利用物理或化学方法将酶或细胞固定在一定空间内的技术。

考点二、固定化细胞技术常用的方法
　　包埋法、化学结合法和物理吸附法。一般来说，酶更适合采用化学结合法和物理吸附法固定化，细胞多采用包埋法固定化。

考点三、酵母细胞的固定化及发酵程序
　　酵母细胞的活化→配制物质的量浓度为0.05 mol/L的CaCl2溶液→配制海藻酸钠溶液→海藻酸钠溶液与酵母细胞混合→固定化酵母细胞→冲洗→发酵

【技能方法】

1．直接使用酶、固定化酶和固定化细胞的比较

2．酵母细胞的固定化方法

3、海藻酸钠溶液的浓度对包埋酵母细胞数量的影响
　　①海藻酸钠溶液浓度过高，将很难形成凝胶珠。
　　②浓度过低，形成的凝胶珠所包埋的酵母细胞的数量少。

4、海藻酸钠溶液配制注意事项
　　①海藻酸钠溶化时要用小火或间断加热，避免海藻酸钠发生焦糊。
　　②将溶化后的海藻酸钠先冷却至室温，再与酵母细胞混合，避免高温杀死酵母细胞。
　　③固定化酵母细胞时，应将海藻酸钠酵母细胞的混合液用注射器缓慢滴加到CaCl2溶液中，而不是注射，以免影响凝胶珠的形成。

【基础达标】

1．下列选项属于固定化酶技术与固定化细胞技术关系的是（　　）
　A.固定化酶技术是固定化细胞技术的基础
　B.固定化细胞技术是固定化酶技术的基础
　C.固定化酶技术与固定化细胞技术是同时发展起来的
　D.固定化细胞技术先于固定化酶技术
【答案】A
【解析】
　　固定化细胞技术是在固定化酶技术基础上发展起来的，故选A。

2．下列有关固定化酶和固定化细胞的叙述,正确的是（　　）
　A.可用包埋法制备固定化酵母细胞
　B.反应产物对固定化酶的活性没有影响
　C.葡萄糖异构酶固定前后专一性不同
　D.固定化细胞可以催化各种反应底物的一系列反应
【答案】A
【解析】
　　A项正确：细胞难以被吸附或结合,固定化细胞多采用包埋法；B项错误：反应产物积累能影响酶的结构,从而使酶的活性下降；C项错误：葡萄糖异构酶在固定前后专一性不变,都是催化葡萄糖转化为果糖；D项错误：固定化细胞固定的是一系列的酶,可以催化一系列的反应,但不能催化各种反应底物的一系列反应。

3．下面制备固定化酵母细胞的正确步骤是（　　）
　①配制CaCl2溶液　②海藻酸钠溶化　③海藻酸钠溶液与酵母细胞混合　
　④酵母细胞活化　⑤固定化酵母细胞
　A.①②③④⑤ 　　 B.④①③②⑤ 　　 C.④⑤②①③ 　　D.④①②③⑤
【答案】D
【解析】
　　制备固定化酵母细胞的正确步骤:酵母细胞活化→配制CaCl2溶液→海藻酸钠溶化→海藻酸钠溶液与酵母细胞混合→固定化酵母细胞，故选D。

4．下列关于固定化酵母细胞的制备步骤中不恰当的是（　　）
　A.应使干酵母与水混合并搅拌,以利于酵母细胞活化
　B.配制海藻酸钠溶液时要用小火间断加热的方法
　C.向刚溶化好的海藻酸钠溶液中加入已活化的酵母细胞,充分搅拌并混合均匀
　D.将与酵母细胞混匀的海藻酸钠溶液注入CaCl2溶液中,会观察到CaCl2溶液中有球形或椭球形的凝胶珠形成
【答案】C
【解析】
　　A项正确：应使干酵母与水混合并搅拌，以利于酵母菌活化；B项正确：配置海藻酸钠溶液时要用小火间断加热的方法；C项错误：将海藻酸钠溶液与酵母细胞混合时，需将溶化好的海藻酸钠溶液冷却至室温，加入已活化的酵母细胞，以避免温度过高杀死酵母细胞；D项正确：将酵母细胞混匀的海藻酸钠溶液注入CaCl2溶液中，会观察到CaCl2溶液中有球形或椭球形的凝胶珠形成。

5．下列不属于固定化酶在利用时的特点的是（　　）
　A.有利于酶与产物分离
　B.可以被反复利用
　C.能自由出入依附的载体
　D.一种固定化酶一般不能催化一系列的酶促反应
【答案】C
【解析】
　　固定化酶是指用物理学或化学的方法将酶与固相载体结合在一起形成的仍具有酶活性的酶复合物，在催化反应中，它以固相状态作用于底物，反应完成后，容易与水溶性反应物和产物分离，可被反复使用，AB项错误，C项正确；能催化一系列的酶促反应是固定化细胞的优点，D项错误。

【能力提升】

1．下列关于使用固定化酶生产高果糖浆的说法,正确的是（　　）
　①生产高果糖浆需要使用果糖异构酶　
　②在反应柱的顶端装上分布着许多小孔的筛板,防止异物的进入　
　③将葡萄糖溶液从反应柱的上端注入,果糖溶液从反应柱的下端流出　
　④反应柱可以降低生产成本,提高果糖的产量和质量
　A.①②　　B.②③　　 C.③④　　D.①④
【答案】C
【解析】
　　生产高果糖浆时所用的酶应为葡萄糖异构酶，①错误；将这些酶固定在一种颗粒状的载体上，再将这些酶颗粒装到一个反应柱内，柱子底端装上分布着许多小孔的筛板，②错误；酶颗粒无法通过筛板上的小孔，而反应溶液却可以自由出入，生产过程中，将葡萄糖溶液从反应柱的上端注入，使葡萄糖溶液流过反应柱，与固定化萄萄糖异构酶接触，转化成果糖，从反应柱的下端流出，③正确；反应柱能连续使用半年，大大降低了生产成本，④正确。故选C。

2．下列有关配制海藻酸钠溶液的叙述中,不准确的是（　　）
　A.加热使海藻酸钠溶化是操作中最重要的一环
　B.海藻酸钠的浓度关系到固定化细胞的质量
　C.海藻酸钠可在水中迅速溶解,必须再加热
　D.海藻酸钠的浓度过低,形成的凝胶珠内包埋的细胞过少
【答案】C
【解析】
　　海藻酸钠需经小火间断加热溶化并冷却后再与细胞混合，海藻酸钠在水中不易溶解,必须再加热，故选C。

3．下图为某同学利用海藻酸钠固定化酵母细胞的实验结果，出现此结果不可能原因有（　　）

　A.海藻酸钠浓度过高　　　　
　B.酵母细胞已经死亡
　C.注射器中的溶液推进速度过快　　
　D.注射器距离CaCl2溶液液面太近
【答案】B
【解析】
　　图中凝胶珠不成球形，可能的原因是海藻酸钠浓度过高导致的，也可能是注射器距离CaCl2溶液液面太近或注射器中的溶液推进速度过快导致的，但是从图中无法看出酵母细胞的死活，故选B。

4．下图1表示制备固定化酵母细胞的有关操作，图2是利用固定化酵母细胞进行酒精发酵的示意图。下列叙述错误的是（　　）

　A.刚溶化的海藻酸钠应迅速与活化的酵母菌混合制备混合液反应
　B.图1中X溶液为CaCl2溶液，其作用是使海藻酸钠形成凝胶珠
　C.图2发酵过程中搅拌的目的是为了使培养液与酵母菌充分接触
　D.图1中制备的凝胶珠用蒸馏水洗涤后再转移到图2装置中
【答案】A
【解析】
　　A项错误：冷却的海藻酸钠溶液再与活化的酵母菌混合制备混合液；B项正确：图1中X溶液为CaCl2溶液，其作用是使海藻酸钠形成凝胶珠稳定结构；C项正确：图2发酵过程中搅拌的目的是为了使培养液与酵母菌充分接触，提高化学反应；D项正确：图1中制备的凝胶珠用蒸馏水洗涤后再转移到图2装置中进行发酵。

5．固定化酶是从20世纪60年代迅速发展起来的一种技术。科研人员用海藻酸钠作为包埋剂来固定小麦酯酶，以研究固定化酶的相关性质和最佳固定条件。酶活力为固定化酶催化化学反应的总效率，包括酶活性和酶的数量。下图甲、乙、丙为部分研究结果。下列有关叙述中，错误的是（　　）

　A.由甲图可知，固定化酯酶比游离酯酶对温度变化适应性更强
　B.由乙图可知，浓度为3%的海藻酸钠包埋效果最好
　C.由丙图可知，固定化酯酶一般可重复使用3次，之后若继续使用则酶活力明显下降
　D.固定化酶的酶活力较高，主要原因是增加了酶与底物的接触面积
【答案】D
【解析】
　　A项正确：由甲图可知，当温度变化时，游离酶的酶活力比固定化酶变化明显，说明固定化酯酶比游离酯酶对温度变化适应性更强且应用范围较广；B项正确：当海藻酸钠浓度较低时，凝胶的孔径较大，固定化酶容易流失，所以酶活力较低，浓度大难以形成凝胶珠；C项正确：由丙图可知，当使用次数多于3次时，酶活力显著下降；D项错误：固定化酶优点是不溶于水，易与产物分离，可反复使用，能保证酶的数量。

【终极闯关】

1、（2015上海卷）下图中符合固定化酶的特征的是（　　）

【答案】D
【解析】
　　固定化酶应用的特点是①可以被反复利用②有利于酶与产物分离③一种固定化酶只催化一种酶促反应，D正确。

2.（2015江苏卷）下列关于固定化酶和固定化细胞的叙述,错误的是（　　）
　A. 固定化酶的主要目的是实现酶的重复利用
　B. 溶解氧交换受阻是固定化酶应用的重要限制因素
　C. 固定化细胞用于生产能分泌到细胞外的产物
　D. 凝胶与被包埋细胞之间不是通过共价键结合
【答案】B
【解析】
　　固定化酶实现了酶和底物的分离，酶可重复利用，A正确；酶的催化作用不需要氧气，故固定化酶的应用不需要氧气，与溶解氧交换受阻没有关系，B错误；固定化细胞可用于生产分泌到细胞外的产物，如分泌蛋白等，C正确；凝胶与被包埋细胞之间没有化学键，不通过共价键结合，D正确。

3.（2012上海卷）酶在大规模产业化应用中的核心问题是固定化技术，而酶固定化所依据的基本原理在于酶具有（　　）
　A．热稳定性　　B．催化高效性　　C．催化特异性　　D．可反复使用性
【答案】D
【解析】
　　固定化酶指通过物理或化学的方法，将水溶性酶与非水溶性载体结合，既能与反应物接触又能与产物分离，与直接使用酶相比，除催化效率高、特异性强外，还可反复使用酶；酶的热稳定性一般都不强。故D正确。

4、（2015届江苏省淮安市高三模拟）下列关于酶的应用的说法中，合理的是
（　　）
　A.使用加酶洗衣粉先用热水浸泡洗衣粉和衣物，洗涤效果好
　B.污渍成分比较复杂时应选用复合加酶洗衣粉，以减少用量
　C.加酶洗衣粉中的酶制剂需用特定材料包裹，属于固定化酶
　D.固定化酶可以反复使用，且固定化后不会影响酶的催化活性
【答案】B
【解析】
　　A项错误：用热水浸泡加酶洗衣粉，会使其中的酶变性失活，导致洗涤效果不佳；B项正确：复合加酶洗衣粉含有多种酶制剂，对于污渍成分比较复杂的衣物较适用，从而减少洗衣粉的用量；C项错误：洗衣粉中的酶没有用包埋法、化学结合法和物理吸附法这些步骤，是完全游离状态的，不是固定化酶；D项错误：固定化酶实质上是将相应酶固定在不溶于水的载体上，实现酶的反复利用，但固定时可能使酶的结构产生变化，从而改变酶的催化活性固定化酶实质上是将相应酶固定在不溶于水的载体上，实现酶的反复利用，但固定时可能使酶的结构产生变化，从而改变酶的催化活性。

5.（2015山东卷）乳糖酶能够催化乳糖水解为葡萄糖和半乳糖，具有重要应用价值。乳糖酶的制备及固定化步骤如下：

　　(1)筛选产乳糖酶的微生物L时，宜用__________作为培养基中的唯一碳源。培养基中琼脂的作用是__________从功能上讲，这种培养基属于___________。
　　(2)培养微生物L前，宜采用__________方法对接种环进行灭菌。
　　(3)纯化后的乳糖酶可用电泳法检测其分子量大小。在相同条件下，带电荷相同的蛋白质电泳速度越快，说明其分子量越___________.
　　(4)乳糖酶宜采用化学结合法（共价键结合法）进行固定化，可通过检测固定化乳糖酶的___________确定其应用价值。除化学结合法外，酶的固定化方法还包括___________、_____________、离子吸附法及交联法等。

【答案】
　　（1）乳糖　　凝固剂　　选择培养基　　
　　（2）灼烧
　　（3）小　　（4）（酶）活性[或（酶）活力]　　包埋法　　 物理吸附法（注：两空可颠倒）
【解析】
　　（1）已知乳糖乳糖酶能够催化乳糖水解为葡萄糖和半乳糖，筛选产乳糖酶的微生物L时，宜用乳糖作为培养基中的唯一碳源，培养基中琼脂的作用是凝固剂，从功能上讲，这种培养基属于选择培养基。
　　（2）为了避免杂菌污染，在培养微生物前，对接种环等接种工具应采用灼烧灭菌。
　　（3）用电泳法纯化乳糖酶时，若在相同条件下分离带电荷相同的蛋白质，则其分子量越小，电泳速度越快。
　　（4）固定化酶的应用价值与酶的活性（或活力）有关，因此用化学结合法固定化乳糖酶时，可通过检测固定化乳糖酶的活性（或活力）来确定其应用价值。固定酶化的方法包括化学结合法、包埋法、物理吸附法、离子吸附法及交联法等。
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