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水母毒素的分离提取及溶血活性研究
【摘要】 　　目的 研究水母毒素的提取及其溶血活性的影响因素。方法通过缓冲溶液浸取、超声波细胞破碎等操作从水母触手的刺丝囊中提取毒素，采用分光光度法对水母毒素的溶血活性进行测定，并研究了温度、浓度和二价金属离子等因素对毒素溶血活性的影响。结果水母毒素的溶血活性对温度敏感，随着浓度的提高而增大，并且依赖于Ca2+，Mg2+等二价金属离子的存在。 结论水母毒素具有较强的溶血活性，但不稳定。
【关键词】 水母毒素；提取；溶血活性
　　Abstract:ObjectiveTo study the extraction and the affecting factors to haemolytic activity of jellyfish　venom was extracted from the oral arms with tentacles through such operations as soaking in buffer solution and disrupting cell in supersonic wave. Activity of the venom to chicken red blood cells was detected by spectrophotometric method. The effects of factors such as temperature, concentration, divalent metal cations on the haemolytic activity were studied. ResultsThe haemolytic activity was temperature-sensitive, and improved with the concentration increase. The presence of Ca2+,Mg2+ wass necessary for haemolytic　haemolytic activity of jellyfish venom is relatively strong, but it is unstable.
　　Key words:Jellyfish venom; Extraction; Haemolytic activity

　　生物毒素是生物活性最高、毒性最大的一类化学物质，对探索生命运动过程和发展新药均有重要价值。药物是指对失调的机体呈现有益作用的化学物质。药物的药理活性和毒副作用主要取决于药物分子的化学结构。化学结构与药物效应之间的关系是药物研究的重要依据。海洋生物毒素所特有的化学结构使其极有可能成为特异的高活性、高药效的先导化合物，以具有确定药理效用的海洋毒素为先导化合物，对先导化合物进行结构或性能的改造，寻求新的疗效更好的药物是当前新药研究的重要方向之一［1,2］。

　　水母属于腔肠动物门，是一个重要的海洋浮游生物类群，它种类多、数量大，分布广泛，我省黄海领域就具有丰富的水母资源，主要的水母品种有海蛰、海月水母和多管水母等。对于具有食用价值的海蛰已经于2004年实现了全人工育苗养殖，如江苏连云港市已经在赣榆、宿城、燕尾港等地建立了养殖基地。水母在食用及药用上都具有研究、开发的价值，自古以来水母用于传统中药，有清热解毒、软坚散结、降压、抑菌、抗衰老的功效，可用于治疗高血压病、气管炎、哮喘、胃溃疡、中枢神经系统疾病等，并可作为神经组织的活性物质和组织胺释放剂。水母的触手上分布着腔肠动物所特有的刺丝囊，其中含有大量的毒素成分。毒素蛋白是水母的主要活性成分之一，它是结构新颖独特的肽类毒素，具有多种生物活性，如溶血性、酶活性、神经毒性、皮肤坏死、肌肉毒性、肝脏毒性以及心脏毒性等［3,4］。

　　溶血毒素(Hemolysin)是指多由病原微生物所产生的，能导致机体红细胞及其他有核细胞裂解的毒素类物质，它存在于环节动物、节肢动物、软体动物、棘皮动物等动物的血清或体液中，可以单独作为调理因子或通过蛋白水解酶发挥作用，其活性大小通过溶解脊椎动物的血细胞表示，最终的溶解效应被称作溶血活性。目前溶血毒素研究以微生物为主，无脊椎动物溶血毒素研究报道非常少，有关水母毒素溶血性能的研究报道很少［5］。本实验通过缓冲溶液浸取、超声波细胞破碎等技术从水母触手的刺丝囊中提取水母毒素，采用分光光度法对其溶血活性进行测定，并研究温度、pH 值、金属离子等理化因子对其溶血活性的影响。
　　1 材料与方法1 水母的采集
　　水母于200607采集于江苏燕尾港附近海域的人工养殖场，扇形带刺丝囊的触手沿水母口腕人工切除分放在食品级聚乙烯塑料袋中，扎好封口后，立即于-20℃冷冻保存备用。2 水母毒素的提取及浓度测定
　　取一定重量的冷冻的水母触手，在冷冻状态下放入浸取剂中，在保持温度低于4℃的条件下浸泡3 h，匀浆10 min后，超声波破碎，超声波功率200 W、总工作时间2 min、工作/间隙时间15/30S。破碎后的物料于4℃、13 000 r/min的条件下高速冷冻离心15 min，所得到的上清液即为水母毒素粗品。以牛血清白蛋白(BSA)作标准，在塑料器皿中用Bradford法(1976)测定水母毒素粗品中蛋白质的浓度C(mg/ ml)。3 鸡红细胞悬液的制备
　　采集新鲜鸡血50 ml，2 000 r/ min离心5 min，取上层液体，以pH 的磷酸盐缓冲溶液离心洗涤3次，用磷酸盐缓冲溶液配成体积分数为1%的鸡红细胞悬液，4℃冰箱保存备用。 4 水母毒素溶血活性的测定方法
　　取2 ml体积分数为1%的鸡红细胞悬液与一定量的水母毒素混合均匀，37℃保温30 min，间歇振荡。在对照管中加入2 ml体积分数为1%的鸡红细胞悬液和0. 5 ml磷酸盐缓冲溶液，与实验管同时保温，取出后立即冰浴以终止反应，经2 000 r/min 离心5 min后获得上清液。以对照管上清液作空白，于540 nm处测吸光度(A)，A值每增加定义为1个溶血活性单位。所测定必须重复3次，记录3次结果的平均值。5 理化因素对水母毒素溶血活性的影响 浓度、温度对溶血活性的影响
　　在8支实验管中取一定量的水母毒素与2 ml体积分数为1%的鸡红细胞悬液混合均匀，使水母毒素的最终浓度分别为：,,，，，，， μg/ml。将上述水母毒素实验管分别在4，25，37，45，60100℃下恒温处理20 min后，按“”的方法检测其对鸡红细胞的溶血活性。
　　二价金属离子对溶血活性的影响
　　为研究二价金属离子对水母毒素溶血活性的影响，并排除其他离子的干扰，将水母毒素在4℃的缓冲溶液中透析4 h，透析缓冲溶液的组成为： mol/L，pH 的磷酸缓冲液100 ml中加入1 g十二烷基硫酸钠和1 ml b-巯基乙醇。

　　取2 ml体积分数为1%的鸡红细胞悬液与 ml透析过的水母毒素混合均匀放入9支实验管，1～9#实验管中分别加入0. 1 ml的不同浓度的CaCl2、MgCl2、ZnCl2溶液，使二价金属离子的最终浓度分别为5，10，15 mmol/ L，10#实验管中加入2 ml鸡红细胞悬液和透析过的水母毒素、11#实验管中加入2 ml鸡红细胞悬液和未透析的水母毒素，对照管中加入0. 1 ml磷酸盐缓冲溶液作为空白对照，实验管和对照管同时在37℃处理30 min，检测溶血活性。所有实验管的水母毒素蛋白的最终含量都为 μg/ml。
　　2 结果
　　温度、浓度对水母毒素溶血活性的影响
　　结果见表1。由实验结果可以看出，在实验浓度范围内，随着水母毒素浓度的提高，溶血活性增大。当浓度低于 μg/ml，几乎没有活性；当浓度高于 μg/ml，活性增大不显着。表1 不同浓度的水母毒素经不同温度预处理后的溶血活性浓度
随着预处理温度的提高，水母毒素的溶血活性降低，预处理温度高于45℃时，溶血活性显着大幅度下降。预处理温度达到100℃时，毒素蛋白变性，溶血活性完全丧失。这反映水母毒素的溶血活性对热是非常不稳定的。
　　二价金属离子对溶血活性的影响
　　金属离子对溶血活性的影响实验结果见表2。结果显示，水母毒素透析后，溶血活性显着降低；添加CaCl2，MgCl2，ZnCl2后，溶血活性增大，并且随着二价金属离子浓度的提高，活性增强。说明水母毒素的溶血活性依赖于二价金属离子的存在，与类似的文献报道一致［5］。表2 不同浓度金属离子作用下的水母毒素溶血活性
　　3 结论
水母毒素的溶血活性对温度敏感，当预处理温度高于25℃时，活性明显下降，100℃时完全失去活性。
水母毒素的溶血活性随着浓度的提高而增大，但当浓度高于μg/ml，活性增大不显着。
水母毒素的溶血活性依赖于Ca2+、Mg2+等二价金属离子的存在，且在一定范围内随着二价金属离子浓度的提高，活性增强。
【参考文献】
　　［1］胡延春，贾艳，张乃生. 生物毒素的应用研究［J］.生物技术通讯，2004，(1)：84.
　　［2］李光友，刘发义. 海洋生物活性物质的研究与开发技术［M］.青岛：青岛海洋大学出版社，2000.
　　［3］张奕强，许实波. 水母的化学和药理学研究概况［J］.中国海洋药物，1999，(1)：43.
　　［4］L. Gusmani, M. Avian, B. Galil, P. Patriarca and G. Rottini. Biologically Active Polypeptides in the Venom of the Jellyfish Rhopilema nomadica［J］.Toxin,1997, 35(5): 637.
　　［5］John J. Chung, Lal A. Ratnapala, Ian M. Cooke, et al. Partial Purification and Characterization of a Hemolysin (CAH1) from Hawaiian Box jellyfish (Carybdea alata) venom［J］.Toxin,2001, 39:981.