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乙肝小三阳血清HBVDNA定量检测及其与前S1关系的研究

　　［摘 要］ 目的：检测乙型肝炎小三阳患者HBVDNA含量，并与前S1抗原(PreS1)进行比较分析。方法：收集351例乙型肝炎小三阳患者血清和30例正常体检者血清，用ELISA方法检测前S1抗原，用荧光定量PCR方法定量检测HBVDNA。结果：HBsAg、抗HBe、抗HBc阳性(小三阳)患者HBVDNA检出率为%(×106 copies／ml)，前S1抗原检出率为%。结论:HBeAg转阴者也存在病毒复制，HBVDNA与前S1抗原相关性较好，对于乙型肝炎患者在常规血清学标志物检测的基础上对HBVDNA数量进行动态检测有助于临床诊断、疗效观察及预后判断。
　　［关键词］ 乙型肝炎；HBVDNA；前S1抗原
　　Study the Relationship of HBVDNA Quantitatively Detection and PreS1 for the Patients of Hepatitis B with Positive of HBsAg、AntiHbe and AntiHBc
　　Abstract：Objective To determine hepatitis B virusDNA(HBVDNA) and pre S1 antigen in patients with hepatitis B and expolore their different clinical　351 positive serum of HBsAg,antiHBe,antiHBc of hepatitis B and 30 healthy man wrer S1 antigen and HBV markets were detected with ELISA and HBVDNA with fluorescent quantitative PCR(FQPCR)　The positive rates of HBVDNA and PreS1 antigen were %(×106 copies／ml)、% respective in patients with hepatitis B of which HBsAg、antiHBe、antiHBc were　There were replication of virus in patients with HBeAg negative,The serum levels of HBVDNA of patients with hepatitis B closely correlate PreDNA with fluorescent quantitative PCR for the patients with hepatitis B is helpful to clinical diagnosis、clinical evalution and prognosis.
　　Key words：Hepatitis B；HBVDNA；PreS1 antigen
　　乙型肝炎血清标志物的检测方法有多种，寻求快速、敏感和特异性检测手段具有十分重要的意义。前S1(PreS1)抗原已成为HBV感染、复制和乙肝患者诊断、治疗和预后的一个重要标志，但存在“窗口期”及“免疫逃避株”等问题。乙型肝炎病毒HBVDNA含量是判断病毒复制活跃和具有传染性的直接可靠依据，HBVDNA定量测定可以反映乙型肝炎病毒(HBV)的量的变化，直接检测患者血清中病毒的拷贝数量，反映患者病毒血症的水平。本研究观察了乙肝小三阳患者血清标志物、前S1和HBVDNA三者之间的相关性，探讨了HBVDNA检测的临床意义,现报道如下。
　　1 材料与方法
1 标本 收集我院351例乙型肝炎小三阳患者血清,其中男273例，平均年龄岁，女78例，平均年龄岁，健康对照30例,男25例，平均年龄岁，女5例，平均年龄岁。留取清晨空腹静脉血，分离血清，-20 ℃保存待检。
2 仪器 RSP150/8全自动加样器(瑞士TECAN公司生产)，BEPⅢ全自动酶免疫分析仪(德国DadeBehring公司生产)，美国ABI公司AB770型PCR荧光定量仪。
3 方法
血清标志物(HBsAg、抗HBs、HBeAg、抗HBe、抗HBc)检测 应用ELISA方法，试剂由上海实业科华生物技术有限公司提供，试剂批号分别为：20060718、20061013、20060913、20060925、20060924。用瑞士TECAN公司生产的加样器(RSP150/全自动酶免分析仪)进行加样(包括质控血清、阴阳性对照及待检血清)，然后用BEPⅢ全自动酶免疫分析仪进行检测，判定方法严格按照说明书进行。
前S1抗原检测 采用双抗体夹心ELISA法，用抗前S1和抗HBs作为固相化抗体和酶标抗体，单抗捕获待检标本中的乙肝病毒表面抗原，用辣根过氧化物酶标记的抗PreS1单抗作为检测抗体。严格按照试剂盒说明书的检测步骤进行操作，根据酶底物反应后的呈色吸光值，测定血清中乙肝病毒PreS1，试剂由上海阿尔法生物技术有限公司提供，试剂批号：20060601。
HBVDNA定量测定 采用PCR方法结合荧光探针体外扩增和检测技术，试剂由深圳匹基生物工程股份有限公司，该试剂盒的检测下限为×108 copies／ml，试剂批号：20060301。
4 统计分析计数资料 采用配对计数资料卡方检验，所有数据用SPSS 处理。

　　2 结果
　　HBsAg、抗HBe、抗HBc阳性组(小三阳组) HBVDNA检出率为%其HBVDNA平均含量为×106 copies／ml；前S1抗原检出率为％。可见部分HBeAg转阴患者仍存在病毒高复制。30例健康对照者血清HBV标志物、HBVDNA及前S1均为阴性，结果见表1。
　　表1 351例乙肝小三阳患者血清HBVDNA及前S1抗原检测结果(略)
　　乙型肝炎小三阳患者PreS1与HBVDNA的关系 351例乙型肝炎小三阳患者血清中，HBVDNA阳性为220例，PreS1阳性为256例，其阳性检出率分别为%(220／351)、%(256／351)。HBVDNA阳性组中PreS1检出率为%(170/220)，HBVDNA阴性组中PreS1检出率为%(86/131)，PreS1与HBVDNA检出率不一致，HBVDNA与PreS1检出率差异有统计学意义(χ2=，)，见表2。
　　表2 乙型肝炎小三阳患者血清PreS1与HBVDNA的关系(略)
　　3 讨论
　　HBV血清标志物检测是目前诊断乙肝最常用的指标，它主要反映人体对乙肝病毒的免疫反应状态，不能直接反映HBV在患者体内的复制情况。由于HBV血清标志物复杂多样，临床上难以根据这些结果对HBV感染复制情况进行准确判断。HBV的外衣壳蛋白包括S蛋白、前S1蛋白和前S2蛋白，研究显示，前S1蛋白含有肝细胞膜受体，与病毒侵入肝细胞以及HBV复制关系密切［1］。PreS1作为病毒复制的标志物之一被广泛应用于临床。ELISA抗原检测方法一般需要1015～1017个病原体才可检测出阳性，而病毒感染后“窗口期”则会出现假阴性结果。荧光定量PCR技术的出现，解决了病原体感染后的发病时间、病情轻重与病原体数量的关系［2］。探讨HBV血清标志物、前S1、HBVDNA检测及其相互间的关系对于乙型肝炎临床诊断、疗效观察和预后判断具有重要意义。本研究采用ELISA及FQPCR方法检测351例乙型肝炎小三阳患者血清标本的前S1、HBVDNA，结果显示小三阳患者血清中HBVDNA检出率达%。HBVDNA平均含量为×105 copies／ml；PreS1检出率为%。通常认为HBeAg阳性是HBV复制活跃的指标之一，本研究结果表明HBeAg阴性并不表明HBV复制的完全终止或病毒血症的消失，该结果和Pichoud等［3］的报道基本一致，病毒拷贝数与HBeAg阳性相比明显下降，表明在HBV感染者体内HBeAg向抗HBe血清转换的动态过程中，病毒的复制逐渐减少。前S1与HBVDNA检出率并不一致，可能是前S1和HBVDNA检测所表达的意义并不完全一致，慢性乙型肝炎病程早期(HBsAg阳性)，HBVDNA阳性而PreS1阴性；病程后期，部分病例PreS1阳性而HBVDNA为阴性。因此，不能仅依照PreS1来判断病毒是否复制，PreS1不能完全代替HBVDNA的检测，只能作为其补充的指标。传统观念认为慢性乙肝患者出现HBeAg转阴或转为HBeAb阳性后传染性小，病情好转，常作为抗病毒治疗有效的指标。本研究表明，HBeAg阴性乙肝小三阳患者血清采用敏感的DNA信号扩增法约40%可检出病毒活动性复制，其中约70%为HBV前C/C区变异的突变株［4，5］，而对于HBeAg阴性慢性乙肝患者，是否存在HBVDNA复制是判断病情与预后、衡量抗病毒疗效的关键指标。有研究认为前S1抗原与HBV复制有更密切关系，PreS1作为病毒复制的重要指标，较HBeAg敏感。在本研究中，PreS1与HBVDNA高度相关，表明PreS1与HBV的复制具有一致性但HBVDNA阳性组中PreS1检出率为%，和HBVDNA的检出率差异有显着性，因此认为临床上判断病毒的复制及其活跃程度不能单靠HBeAg或PreS1是否阳性，准确的方法是荧光定量PCR方法对HBVDNA进行定量检测。血清中HBVDNA的量是反映病毒复制的最直接标志，是评价传染性的最可靠的方法，荧光定量PCR技术能从DNA水平鉴别其潜伏性和活动性，可以作为HBV感染的分子诊断标准因此对于乙型肝炎病毒感染者，在常规血清学标志物检测的基础上，采用FQPCR方法对HBVDNA数量进行动态观测，对乙型肝炎的诊断、抗病毒治疗的药物疗效评价、指导乙型肝炎合理治疗方案的制订以及预后判断有非常重要的意义。
　　参考文献：
　　［1］ 卢建华，宋晨朝，郎振为，等．前S1蛋白检测在慢性乙型肝炎患者病理诊断中的价值［J］．中华传染病杂志，2006，24(1)：6062.
　　［2］ 姚磊，潘海龙，张征，等．59 434例就诊者血清乙肝病毒标志物的检出与分析［J］．重庆医学，2003，32(4)：469.
　　［3］ Pichoud C,Berby F,Stuyver L,et　of viral replication after antiHb seroconversion during antiviral therapy for chronic hepatitis［J］.B J Hepatol,2003,32:307.
　　［4］ Ikeda K,Arase Y,Saitoh S,et term outcome of HBV carriers with negative HBe antigen and normal aminotransferase［J］.Am J ，119(11):977985.
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