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RNA干扰技术抑制乳腺癌SKBr3细胞HER2的表达
【摘要】 构建含表皮生长因子受体2基因(HER2)的短发夹状双链RNA(shRNA)重组质粒,体外观察对人乳腺癌细胞SKBr3的HER2 mRNA及蛋白表达的影响。方法利用分子克隆技术,将含HER2的双链DNA,与经双酶切后的载体pSilencer连接,构建pSilencerHER2重组质粒,在脂质体的介导下转染高表达HER2的乳腺癌细胞系SKBr3。RTPCR分析HER2 mRNA的表达,Western blot检测蛋白的表达,MTT法测定细胞增殖情况。结果酶切鉴定证实重组质粒构建成功,转染后能明显抑制HER2 mRNA及蛋白的表达抑制细胞的增殖。结论构建的pSilencerHER2重组质粒能有效地降低人乳腺癌细胞HER2的表达,抑制细胞的增殖,为HER2高表达预后不良的乳腺癌基因治疗提供新策略。
【关键词】 RNA干扰 受体 表皮生长因子 乳腺肿瘤 瘤细胞 培养的 基因表达
表皮生长因子受体2(HER2)在包括乳腺癌在内的多种上皮源性肿瘤中过度表达,与乳腺癌的发生、发展、预后等关系密切[1],是极具发展前途的基因治疗靶位。约有30％乳腺癌患者伴随有HER2及其基因产物的过表达,HER2过表达是乳腺癌病人不良预后的重要标记物。RNA干扰是近年来发展起来的基因阻断技术,它通过将双链RNA(doublestranded RNA,dsRNA)导入细胞后,在Dicer酶的作用下产生有活性的小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA),与该段RNA同源mRNA产生特异性降解,从而导致特异基因表达抑制的转录后基因沉默现象。笔者采用RNA干扰(RNAi)技术抑制人乳腺癌细胞株SKBr3细胞HER2的表达,探讨利用质粒表达载体体内合成siRNA的方法能否有效介导肿瘤细胞出现RNAi，从而为乳腺癌的基因治疗提供新策略。
1材料和方法
材料
细胞株SKBr3细胞(人乳腺癌细胞株，湖南远泰生物技术有限公司)。
主要试剂MMuLV逆转录酶、TaqDNA聚合酶(立陶宛MBI公司);质粒H1 neo(美国Ambion公司);限制性内切酶BamHⅠ、HindⅢ和T4DNA连接酶、100 bp DNA ladder(大连宝生物技术公司);RMPI 1640培养基、Trizol和Lipofectamine 2000(美国Invitrogen公司);MTT(美国Sigma公司);鼠抗人HER2单克隆抗体(美国R&D公司);TMB Western Blot试剂盒(美国KPL公司)。
图1pSilencer质粒图谱
Fig 1pSilencer plasmid map
方法
构建短发夹状双链RNA(shRNA)重组质粒根据GenBank数据库提供的HER2基因序列(NM004448),按照siRNA的设计原则,利用Ambion公司在线设计软件设计siRNA序列,筛选出1个19核苷酸的靶序列,用siRNA Hairpin寡核苷酸序列设计软件设计成双链发夹结构,双链的5’端引入BamHⅠ位点,3’端引入HindⅢ位点,中间9个核苷酸是用于形成发夹结构,在3’端有一个TTTTTT的终止信号。
DNA正义链
5’GATCCGGACATCTTCCACAAGAACTTCAAGA
GAGTTCTTGTGGAAGATGTCCTTTTTTGGAAA3’
DNA反义链
3’GCCTGTAGAAGGTGTTCTTGAAGTTCTCTCA
AGAACACCTTCTACAGGAAAAAACCTTTTCGA5’
由大连宝生物工程公司合成,2条DNA链退火形成双链DNA,与线性化载体在16 ℃连接过夜,无义对照质粒由美国Ambion公司提供,转化感受态大肠杆菌。随机挑选转化菌落,小量提取质粒,进行酶切鉴定,鉴定正确的shRNA重组质粒(pSilencerHER2)进行测序。
细胞培养人乳腺癌细胞SKBr3,用含10%小牛血清的RPMI 1640培养基,于37 ℃、体积分数为的CO2培养箱中常规培养和传代。
细胞转染转染前1 d,将SKBr3细胞接种6孔板,每孔3×105,3 mL,置37 ℃、体积分数为的CO2培养箱培养过夜,待细胞生长融合达85%~90%后,采用siPORT XP1试剂(美国Ambion公司)按说明书方法进行转染,每孔加入脂质体 μL和重组质粒pSilencerHER2　μg,同时转染无义质粒(pSilencerneospecial)作为对照。转染48 h后检测目的基因的表达。
PCR检测HER2基因表达用Trizol按说明书方法抽提转染48 h后细胞总RNA,用紫外分光光度计定量,经MMlv酶反转录为cDNA。采用Primer premier 软件设计引物,
HER2引物
上游:5’CCATCAAAGTGTTGAGGGAAAAC3’
下游:5’AATCTGCATACACCAGTTCAGCA3’
PCR产物778 bp,内参照GAPDH引物
上游:5’GGTGAAGGTCGGAGTCAACG3’
下游:5’CAAAGTTGTCATGGATGACC3’
PCR产物500 bp,PCR反应体系总体积为50 μL,内含模板cDNA 100 ng,引物 μmol/L,dNTP　μmol/L,MgCl2　mol/L和TaqDNA聚合酶 U。PCR反应条件为:94 ℃变性5 min进入循环,94 ℃ 60 s→59 ℃ 60 s→72 ℃ 60 s,经30个循环扩增后72 ℃延伸10 min。取PCR产物10 μL用%琼脂糖凝胶电泳分析,凝胶自动成像仪直接观察,并行光密度扫描和图像分析,以HER2/GAPDH的光密度比值表示相对表达水平。
　blot检测细胞HER2蛋白表达水平按试剂盒说明书方法操作。将转染48 h后的pSilencerHER2重组质粒组、无义质粒组及未转染组细胞分别用PBS洗3次,以低渗缓冲液(50 mmol/L TrisCl, mmol/L EDTA, mmol/L PMSF, mmol/L DTT,pH )裂解细胞,制备细胞总蛋白,取蛋白100 μg上样进行不连续SDSPAGE电泳,浓缩胶浓度为5%,分离胶浓度为12%。电转移到硝酸纤维素膜后,封闭液过夜,然后与鼠抗人HER2单克隆抗体孵育1 h,再与辣根过氧化物酶
标记的二抗孵育1 h,用TMB显色,拍照。
细胞增殖试验实验分为3组,包括pSilencerHER2重组质粒组、无义质粒组及未转染组。转染前1 d,细胞以1×104 mL1浓度接种96孔培养板中,每孔200 μL,每组设3个复孔,置37 ℃、体积分数为的CO2培养箱培养,每孔以脂质体 μL和重组质粒40 ng进行转染。在转染后1~6 d,每天在同一时间点各取出3个孔进行试验,每孔加入MTT工作液20 μL,37 ℃反应4 h,弃去MTT反应液,加入二甲亚砜200 μL,室温振荡10 min,用酶标仪测定D(570 nm)值,绘制细胞生长曲线。
统计学处理采用SPSS 软件对数据进行非配对t检验。
　　2结果
重组质粒pSilencerHER2的酶切鉴定2条siRNA的DNA模板链在5’端分别引入BamHⅠ及HindⅢ两个酶切位点。以BamHⅠ及HindⅢ双酶切pSilencerHER2,获得66 bp 的插入片段及 kb的线状质粒pSilencer(图1)。将酶切证实的重组质粒进行序列测定，将测序结果与插入序列比对,重组质粒含有与插入序列完全相同的序列,表明所构建的重组质粒含有设计的目的序列。
PCR检测siRNA抑制HER2基因PCR产物电泳可见GAPDH与HER2分别位于500 和778 bp处(图3)。无义质粒转染组HER2 mRNA表达丰度较高,可见明亮的荧光条带,与无义质粒组比较差别无统计学意义()。pSilencerHER2转染组细胞的HER2 mRNA表达明显减弱,差别有统计学意义()。
1:SKBr3未转染组; 2:无义质粒组; 3,4:pSilencerHER2组; M:100 bp DNA Marker.
图3RTPCR扩增的HER2 mRNA电泳图
Fig 3Analysis of HER2 mRNA expression by RTPCR
细胞HER2蛋白表达水平与未转染组相比,转染pSilencerHER2重组质粒的细胞中HER2蛋白的表达明显受到抑制,而转染无义质粒组细胞HER2的表达没有明显降低,结果与RTPCR结果一致(图4)。
1:SKBr3未转染组; 2:无义质粒组; 3:pSilencerHER2转染后24 h; 4:pSilencerHER2转染后48 h.
图4转染细胞蛋白表达的Western blot鉴定
Fig 4Western blot analysis of HER2 protein
重组质粒转染pSilencerHER2对乳腺癌SKBr3细胞增殖影响用MTT法检测各组细胞生长情况,连续检测6 d,根据3次独立实验结果,以D值为纵坐标,以生长时间为横坐标绘制生长曲线(图5)。重组质粒pSilencerHER2转染组细胞生长速度明显变缓,而无义质粒组和未转染组细胞生长相对快,在第5 d基本达到平台期。
3讨论
技术特点RNAi是机体基因表达的一种调控机制,属于转录后水平调控方式的一种。与基因替代、反义寡核苷酸治疗、细胞因子基因治疗等传统的基因治疗相比，RNAi技术有着无可比拟的优势。RNAi抑制基因的表达不但高效特异,而且作用持久、迅速。目前针对于肿瘤特异性相关的靶基因进行RNAi的研究取得了很大的发展。Uchida等研究结果表明应用RNAi技术可以高度特异性地沉默肿瘤细胞靶基因,同时对正常细胞没有影响[46]。
基因作为靶点的理论基础本实验RNAi的靶点是HER2基因，HER2基因的过度表达与乳腺癌的关系极为为密切,不仅与癌细胞的增殖率和发生转移的机会呈正相关,而且对多种化疗、放疗不敏感。这是由于其特有的分子生物功能决定的[78]:(1)强大的促细胞增殖功能,是表皮生长因子受体家族中促增殖作用最为广泛的一员;(2)它增加肿瘤细胞的侵袭力,破坏机体组织抗侵袭屏障,从而促进癌细胞的扩散和转移;(3)通过增加血管内皮生长因子的表达,促进肿瘤新生血管形成;(4)参与化疗耐药的机制,降低对化疗药物的敏感性;(5)参与了抑制细胞凋亡,促进肿瘤细胞存活。这些特殊的分子生物功能奠定了HER2基因能作为乳腺癌生物治疗靶标的理论基础。而且,HER2受体在乳腺癌的表达具有以下特点:(1)虽然仅30％的乳腺癌病人表达HER2,但其表达呈均质的强阳性,即几乎所有的癌细胞都表达大量的HER2分子,使抗HER2治疗能同时针对所有的癌细胞;(2)转移乳腺癌细胞表达HER2受体的强度与原发灶癌细胞一致,因此抗HER2方案可用于治疗已经扩散转移的晚期乳腺癌;(3)HER2在癌细胞表达的水平比正常组织细胞强得多,故抗HER2方案能特异性地针对癌细胞。这些表达特点大大增加了应用抗HER2方案治疗乳腺癌的现实性。
抑制乳腺癌细胞增殖的可能机制实验中用MTT比色分析法检测细胞体外增殖活力,结果显示pSilencerHER2转染组乳腺癌细胞增殖活性明显降低。这结果可能与RNAi HER2基因影响了细胞周期相关信号分子的调控表达有关。Yang等研究表明下调HER2表达导致PI3K、Akt表达下调;Akt表达下调导致周期素cyclin D1表达随之下调;位于染色体11q13的周期素cyclin D1基因编码周期素D1蛋白,在多种肿瘤中过度表达,周期素D1和周期素依赖激酶CDK4/6转配成全酶,催化视网膜细胞瘤蛋白pRb磷酸化,消除其抑制生长功能,启动细胞周期,从G0进入G1期,并推动G1期前进,进入S期,越过G1晚期的检测点,促进DNA复制和细胞分裂,使肿瘤细胞生长失调。本实验使用RNAi技术抑制HER2基因表达,可能进而抑制Akt和周期素D1表达,抑制细胞进入S期,起到周期阻滞的效果,进而抑制细胞增殖。由此可以看出,载体介导的针对HER2基因的RNAi技术能有效地抑制癌细胞的生长,有望被开发成为新一代的抗肿瘤基因药物。
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