安捷伦6400系列液相色谱-三重串联四级杆质谱联用仪现场培训手册.pdf

安捷伦 6400 系列 液相色谱-三重串联四级杆质谱联用仪 现场培训现场培训手册手册 版版 本本 安捷伦科技（中国）有限公司,2010 2010 年 6 月 Rev.6.0 本手册适用于安捷伦 MassHunter 工作站软件 B.02.01 及以上版本。声声 明明 本书内容如有改变，恕不另行通知。安捷伦科技公司对本材料，及由此引起的任何商务和特种用途不承担责任。安捷伦科技公司对本手册中可能有的错误或与装置、性能及材料使用有关内容而带来的意外伤害和问题不负任何责任。如果安捷伦与用户对本书中的警告术语有不同的书面协议，这些术语与本书中的警告术语冲突，则以协议中的警告术语为准。联系方式联系方式 售后服务中心电话：800 820 3278 手机用户：400 820 3278(手机用户需支付本地电话费)免费传真：800 820 1172 电子信箱：lsca-china_ 中文网站：http:/ 目录目录 1.QQQ 基本原理.3 1)离子的产生（ESI）.3 2)离子如何进入质谱.4 3)四级杆的作用(Q1,Q3).4 4)碰撞池的作用(Q2).4 5)两根四级杆协同工作（MRM）.5 6)检测器.5 2.硬件概述.6 1)LC-QQQ 的典型配置.6 2)1290 中各模块典型摆放及介绍.6 3)1200 中各模块典型摆放及介绍.7 4)QQQ 的离子源的种类介绍.7 5)仪器序列号的位置.8 3.基本操作.9 1)开机.9 2)关机.9 3)Masshunter 采集软件介绍.12 4)调谐.15 5)LCMS 方法设定（1200 部分）.17 6)LCMS 方法设定（1290 部分）.18 7)LCMS 方法设定（QQQ 部分）.22 8)运行单个样品.24 9)运行序列样品.25 10)定性分析.29 11)定量分析.34 4.日常维护.45 1)液相的日常维护（1200，及 1290）.45 2)QQQ 的日常维护.47 1.QQQ 基本基本原理原理 1)离子的产生离子的产生（ESI）离子源将进入其中的流动相变成雾状，并且使用高温气体反吹使其迅速蒸发以释放出其中的离子；离子在电场的作用下，最终进入毛细管入口。注意：离子本身就存在于注意：离子本身就存在于溶液中溶液中（APCI 源源不同不同），电喷雾源的作用），电喷雾源的作用仅仅仅仅是提取出溶液中是提取出溶液中已已经经存在的离子。我们可以使用各种促进离子化的流动相，比如正离子模式下加一定量的甲存在的离子。我们可以使用各种促进离子化的流动相，比如正离子模式下加一定量的甲酸，负离子模式下避免使用酸性流动相等手段增加溶液中的离子。酸，负离子模式下避免使用酸性流动相等手段增加溶液中的离子。注意：注意：其中雾化气压力（其中雾化气压力（Nebulizer）；干燥气流量（）；干燥气流量（Gas flow）；干燥气温度（干燥气温度（Gas temp）；和毛细管电压（和毛细管电压（Capillary）的设置对于离子是否能最大化的进入质谱仪起到关键的作用。）的设置对于离子是否能最大化的进入质谱仪起到关键的作用。所以在必要的时候，我们需要优化这些参数。所以在必要的时候，我们需要优化这些参数。APCI 以及 Jet Stream 的原理，请见附录 2)离子如何进入质谱离子如何进入质谱 离子进入四级杆前必须要经过毛细管，八级杆组件。其中毛细管的作用是导入离子，在毛细管末端施加一个电压（Fragmentor 电压），把离子推进八级杆组件中。而八级杆组件的作用大致为导向随机运动的离子，并且让其以一定速度进入四级杆。注意：针对不同离子正确设置注意：针对不同离子正确设置 Fragmentor 电压，能够使得进入的离子大幅增加，起到增电压，能够使得进入的离子大幅增加，起到增高灵敏度的作用。高灵敏度的作用。因此优化因此优化 Fragmentor 电压是必不可少的一部分。电压是必不可少的一部分。3)四级杆的作用四级杆的作用(Q1,Q3)简单地说，四级杆的作用就是依照质核比过滤离子。使得仅仅为选定质核比的离子才能顺利通过四级杆，其余离子均不能通过四级杆。因此四级杆也叫做质量过滤器。每个四级杆都可以工作在以下三种模式下：1，全通过（TTI）；2，选择某个离子通过（SIM）；3，质量扫描（SCAN）。注意：通过第一根四级杆（注意：通过第一根四级杆（Q1）的离子，我们叫做母离子。进入第二根四级杆（）的离子，我们叫做母离子。进入第二根四级杆（Q3）的）的离子，我们叫做子离子离子，我们叫做子离子。子离子由母离子经过碰撞后产生，产生碰撞的位置在碰撞池（。子离子由母离子经过碰撞后产生，产生碰撞的位置在碰撞池（Q2）。）。4)碰撞池的作用碰撞池的作用(Q2)简单的说，碰撞池中充满了高纯氮气。离子在穿过碰撞池的过程中发生碰撞，碎裂成较小的碎片。注意：碰撞注意：碰撞的程度是可控的，使用不同的碰撞能量（的程度是可控的，使用不同的碰撞能量（CE）会产生不同的或者不同丰度的碎）会产生不同的或者不同丰度的碎片。因此优化碰撞能量可以片。因此优化碰撞能量可以大大的改善检测的灵敏度。大大的改善检测的灵敏度。毛细管 八级杆组件 离子源 Fragmentor 电压 四级杆 5)两根四级杆协同工作（两根四级杆协同工作（MRM）Q1 可以看成是一个过滤器，它按照质核比选择一定的离子进入下一级（母离子），不同质核比的离子均被挡在外面。这样的作用相当于对样品进行一次提纯，提取出指定质核比的离子。具有相同质核比的离子会有很多种，需要区分这些相同质核比的离子，我们需要一个反应器。Q2 就是这个反应器，相同质核比的离子碰撞后产生各不相同的的子离子。最后 Q3可以选择由指定母离子产生的子离子通过，从而去除别的离子的干扰。这样的做法就可以大大的减少背景干扰，提高测试样品的灵敏度。另外，Q1 和 Q3 都可以单独工作在 TTI，SIM 和 SCAN 的模式下工作，Q2 也可以选择是否打碎离子。因此 QQQ 还能提供 MS2 SCAN，MS2 SIM，Product ion Scan 等模式，详细见附录。6)检测器检测器 检测器部分是一个放大电路，一个离子可能被放大成 1*10e6 倍或者更多。放大倍数的确定主要依靠 EM 电压的设置，EM 电压设置的越高，放大倍数也就越大。放大后的信号被质谱传递到工作站，由工作站接收后，产生图谱。注意：正确的设置注意：正确的设置 EM 电压可以大大的提高检测的灵敏度，因此优化电压可以大大的提高检测的灵敏度，因此优化 EM 电压的设置很重电压的设置很重要。要。Q1 Q3 Q2 进入质谱的离子 不能通过 Q1的离子 通过Q1的离子（母离子）母离子经过 Q2 产生碎片（子离子）不能通过 Q2的子离子 通过 Q2 的子离子（被选择检测的离子）检测器 2.硬件概述硬件概述 1)LC-QQQ 的典型配置的典型配置 2)1290 中各模块典型摆放及介绍中各模块典型摆放及介绍 检测器 柱温箱 自动进样器 泵 192.168.254.1 192.168.254.11 192.168.254.12 3)1200 中各模块典型摆放及介绍中各模块典型摆放及介绍 4)QQQ 的的离子源的种类离子源的种类介绍介绍 Jet Stream 检测器 柱温箱 自动进样器 泵 脱气机 5)仪器序列号的位置仪器序列号的位置 注意：其中注意：其中 G 开头的为仪器的型号，开头的为仪器的型号，US 或者或者 DE 或者或者 JP 开头的才是仪器的序列号。报开头的才是仪器的序列号。报修是需要告知修是需要告知 800 接线员仪器的型号和序列号。接线员仪器的型号和序列号。G6410 QQQ G6460 QQQ 3.基本操作基本操作 1)开机开机 1 打开液氮罐自增压阀门，调节液氮罐或 N2 发生器的输出压力为 0.56-0.69MPa（80-100psi），调节高纯氮气钢瓶减压表输出压力小于小于 0.2 MPa(一般为 0.15MPa 或10-30Psi）。确认前级泵的气镇阀处于关闭状态。注意：注意：如果液氮和高纯氮输出压力如果液氮和高纯氮输出压力超超过相应过相应最高允许压力最高允许压力，可导致仪器气路控制元件的损，可导致仪器气路控制元件的损坏。坏。2 打开电脑。3 打开 LC 各电源开关。注意：如果装有密注意：如果装有密封圈清洗装置，则是泵运行时，密封圈清洗装置就应该也处于工作状态封圈清洗装置，则是泵运行时，密封圈清洗装置就应该也处于工作状态 4 打开 G6400 系列 QQQ 的电源开关。此时听到一声电磁阀的声音，前级泵启动，然后涡轮泵开始工作，等待大概 2 分钟左右，QQQ 上的 SmartCard4 通讯板完成初始化。5 在电脑上启动 Data Acquisition，此时 MassHunter 软件启动，等待少许时间，采集界面正常打开，表示仪器通讯正常。2)关机关机 1.确认前级泵的气镇阀（Gas Blast Valve）处于关闭状态。此气镇阀在操作状态应定期打开（完全打开再回旋一圈。注意：气镇阀打开后泵声音会增大），建议每周打开一次，每次一个小时，以便泵油能够回流并去除泵油中易挥发的组分。注意：关机前务必确认气镇阀处于闭状态，否则前级泵的泵油可能因此回流到质谱的真空注意：关机前务必确认气镇阀处于闭状态，否则前级泵的泵油可能因此回流到质谱的真空腔内。腔内。2.点击Pump 图标，将泵流量设置到0，然后再次点击选择Off，依次点击柱温箱和检测器选择Off。点击MS QQQ 图标，依下图所示选择Vent。6410 毛细管 Data Acquisition 3.出现下述提示，如果确认要放空，按照提示选择。4.观察涡轮泵转速，以及四极杆和干燥气的温度 5.大约十分钟以后，会出现如下提示：点击OK，关闭MassHunter 软件，然后点击桌面Acq System Launcher 图标，然后选择Shutdown 关闭运行程序。点击 Vent 执行放空步骤 6.关闭MS QQQ及LC各模块的电源。7.关闭电脑。8.关液氮及高纯氮。3)Masshunter 采集软件介绍采集软件介绍 1 软件启动完成后进入采集界面，如下：2 观察仪器状态和真空情况。同颜色代表不同的仪器状态。可以通过浏览在每个界面上的条目来判定QQQ 和HPLC 模块的状态。颜色说明目前模块的状态。绿色说明模块或仪器“Ready”。黄色说明“Not Ready”。在柱子的加热模块到达设定的温度过程中，你经常可以看到这个颜色。红色说明模块中有“Error”。你可以检查日志LogBook 浏览错误信息。蓝色表明系统正在运行。粉红色表明仪器等待进 3 在Actuals 处点击鼠标右键，弹出setup 对话框，选择前级真空；高真空，干燥气流量和压力以及涡轮泵转速；毛细管电流等重要参数到实时状态显示，对于重要数据可以选中该参数，然后用右键设定颜色及字体等等。通常，G6410系列QQQ高真空度可以达到2.73.7 10-5torr,G6430和G6460系列QQQ高真空度可以达到1.92.3 10-5torr。4 在仪器的各个模块上，单击鼠标右键可以快速控制仪器状态 5 方法是进行样品分析的LC、MS的参数的集合，以及分析某个特定样品所需的前运行和后运行任务。可用的方法(*.m)文件显示在Masshunter工作站资源管理器中。在这个界面中完成所有的方法编辑，这里有HPLC 和QQQ各参数项的弹出菜单。4)调谐调谐 为了获取真实、准确质量数的谱图，QQQ 必须对灵敏度和分辨率进行调整优化，并使用已知质量数的离子对质量轴进行校正的过程。调谐包括两种方式：自动调谐和手动调谐。自动调谐是一个自动过程，它在整个质量范围调节QQQ，使其获得最优性能；手动调谐允许用户针对一段质量范围进行调谐优化，从而在一定质量范围达到特定要求。调谐后，被优化、校正过的质谱的参数记录在调谐文件中，被保存下来。1.打开数据采集软件，从Acquisition 切换到Tune 画面，如下图所示：2.调谐有三种模式Autotune Checktune 和Manual Tune，在Manual Tune 画面，有编辑参数对话框，点击Apply 则使更改参数生效。3.点击Autotune 标签，然后点击右侧箭头所示Autotune，CDS 自动工作将调谐液压入喷雾针，自动调谐过程开始，底部%Complete 和Status 显示调谐进程。4.Autotune 调谐结束，自动生成调谐报告。退出调谐界面时请按照提示存储调谐文件，缺省文件名为Atune.TUNE.XML，调谐周期为一月左右一次。注意注意：碰到调谐不能通过的时候，请告之调谐界面下方的：碰到调谐不能通过的时候，请告之调谐界面下方的 Status 栏中的描述，以及调谐栏中的描述，以及调谐完成的百分数。完成的百分数。5.点击Autotune 下面的Checktune 会自动完成检验调谐过程，检验调谐提供了一个不执行完整的Autotune 而快速确定调谐文件是否合适的方法，Checktune 扫描各个质量数的轮廓图并与目标值的峰宽和质量轴进行比较，建议将质量轴偏差范围设定到Unit 0.2、wide 0.5 和和widest 0.8，峰宽偏差设定值如上图参数。注意：注意：Checktune 报告显示有报告显示有 Adjust 并不表示仪器存在问题，也不一定需要重新自动并不表示仪器存在问题，也不一定需要重新自动调谐。您可以将报告发给调谐。您可以将报告发给 Agilent 的技术支持人员进行分析。的技术支持人员进行分析。6.在B.02.01 MassHunter软件中，自动调谐增加了一项Apply Low Mass Tuning。此功能主要针对小离子进行调谐，增加小离子丰度值（小于200的离子有效）。5)LCMS 方法方法设定设定（1200 部分）部分）1.点击自动进样器菜单，设定进样量，设置自动进样器的参数。建议设置带洗针的进样。这样可以显著减少样品交叉污染，一般洗针用样品瓶不要带瓶盖。如果使用的是高性能自动进样器，可以设置成清洗端口洗针，可以更有效的减少进样时样品的交差污染。在Options 中包括抽吸速度，打样速度以及抽吸的位置。设定高通量进样，可以通过减少两次进样的间隔时间，加快样品分析的速度。2.输入泵的流量、流动相比例。Timetable可以让您建立一个梯度程序。也可以编写流量和压力的时间程序。在Option菜单下可以设置冲程、压缩因子、及最大流量梯度。使用二元泵时，设置压缩因子，泵在高压运行时，可以校正泵的流量，稳定压力波动。3.在柱温箱编辑画面输入柱温箱温度，柱温会影响被分析物的保留时间。4.如果您有可变波长检测器，直接设置检测波长。如果您使用的是二级管阵列检测器，请按如下规则设定检测波长和参比波长：样品波长应该选在没有流动相吸收影响、样品吸收最大的位置。在样品吸收最大的位置附近有一个高斯分布峰，样品波长的带宽应该设为半峰宽。参考波长应该选择在尽可能靠近样品信号、吸收很低或没有的地方。参考波长带宽应该大于等于样品波长带宽。6)LCMS 方法设定（方法设定（1290 部分）部分）1 自动进样器设置 注意：如果使用了内插管，一定要注意设置注意：如果使用了内插管，一定要注意设置 Draw Position 以及以及 Vial/Well bottom sensing 这两个参数，如果设置不当会造成进样瓶破碎或者进样器卡住的故障。这两个参数，如果设置不当会造成进样瓶破碎或者进样器卡住的故障。进样方式：1 标准进样 2 洗针进样 3 使用进样程序 4 进样量 洗针方式：1 在进样盘的某个位置洗针 2 使用清洗端口洗针（推荐），并设置洗针时间 使用高通量的进样方式。在运行样品的同时准备好下次的进样。有效节省时间。针自动检测瓶底位置。如果使用内插管，禁止使用这项 停止时间：始 终 设 置 和 泵 一 样（As pump）2 泵参数设定 注意：设定溶剂类型是必须要选取正确的流动相类型（有机相和水相）。否则会造成流量注意：设定溶剂类型是必须要选取正确的流动相类型（有机相和水相）。否则会造成流量不准确或者压力波动比较大不准确或者压力波动比较大 3 柱温箱参数设定：4 DAD 参数设定 设定流量 选择溶剂切换阀位置 设定流动相为水相还是有机相 设定 B 的比例 停止采样的时间 最大和最小压力限制。1290 可以设到最大 1200bar（流量 2ml 以内）后运行时间，一般梯度时用 梯度表设定：很简单，一般只需要设定 B 的百分比和流速（如果流速随时间变化）设定柱温箱右边控温模块的温度，最高为 100 摄氏度，最低为-5 摄氏度。如 果 选 择Same as left 则和左边保持一致 设定柱温箱左边控温模块的温度，最高为 100 摄氏度，最低为-5 摄氏度 运行停止时间，一般设置和泵一致 选择是否保存光谱图。如果保存请设置需要保存的光谱图范围及步长 选择需要测定的波长。Sample:样品波长 Bw:带宽 Reference:参比波长 采样半峰宽的设定。依照色谱图中的半峰宽选择相应的值进行设定。注意：注意：半峰宽的值决定了采样频率的大小，正确的设定半峰宽的值，才能获得比较好的定半峰宽的值决定了采样频率的大小，正确的设定半峰宽的值，才能获得比较好的定量重现性。量重现性。注意：带宽的设定注意：带宽的设定(Bw)不能小于狭缝的宽度。如果需要比较好的灵敏度，带宽推荐设成光不能小于狭缝的宽度。如果需要比较好的灵敏度，带宽推荐设成光谱半峰宽。如果需要比较好的分辨率，带宽应该设置尽量小。参比波长主要为了避免基线谱半峰宽。如果需要比较好的分辨率，带宽应该设置尽量小。参比波长主要为了避免基线漂移和周期性波动，但是参比波长必须选择在没有吸收背景波长范围。漂移和周期性波动，但是参比波长必须选择在没有吸收背景波长范围。注意：如果需要不开灯运行样品，则必须关闭以下部分：注意：如果需要不开灯运行样品，则必须关闭以下部分：Setup-Signals-Store；Setup-Spectrum-Store；Options-Required lamps-UV。5 如何排空泵如何排空泵 点击 1290 Bin Pump 模块的图标，然后选择 Purge and Prime 6 设置柱塞清洗（如果安装）点击 1290 Bin Pump 模块的图标，然后选择 Seal Wash 分析需要的灯，如果不选，打开系统时灯不会开。狭缝宽度设定：狭缝越宽，进光量越大，但是波长的分辨率则越差。勾上 enable purge，并且输入流速，时间，比 例 就 可 以purge 泵头。排空的时 候 阀 会 自 动 切换，无需人为介入。当我们发现泵头里面有气泡出不来的时候，选择 prime on。然后点击 ok。此时泵会用很强烈的方式朝外泵液体，并持续 20 次自动停止。Off:不适用柱塞清洗 Single Wash:按照设定时间清洗一次 Peirodic：在设定的Period 时间内清洗设定的时间 注意：如果使用质谱的流动相（不含结晶性盐），则建议注意：如果使用质谱的流动相（不含结晶性盐），则建议 10 分钟内洗分钟内洗 0.2 分钟即可。柱塞分钟即可。柱塞清洗用的溶剂为清洗用的溶剂为 10%的异丙醇水溶液的异丙醇水溶液。并且只要安装了柱塞清洗附件的仪器，必须使用，。并且只要安装了柱塞清洗附件的仪器，必须使用，否则可能损伤柱塞杆。否则可能损伤柱塞杆。7 设置流动相的量 点击 1290 Bin Pump 模块的图标，然后选择 Set solvent levels 各个通道内流动相残留的量，如果新换或者添加了流动相，需要手工修改这些值 选择后，如果流动相少于设定值时。则不允许进行分析 各个通道盛放流动相的瓶子的容积大小 选择后，如果流动相用完，则自动关闭泵 7)LCMS 方法设定（方法设定（QQQ 部分）部分）在 MS QQQ 参数画面，注意为方法选合适的调谐文件，缺省的调谐文件为Atune.TUNE.XML。下面的例子为一个三聚氰胺的分析方法。在此方法中使用了三个时间段，最后一个为平衡柱子，第一个和第二个时间段分别采用负离子和正离子切换方式 DeltaEMV（+）用于正模式下，DeltaEMV（-）用于负模式下。其目的定量检测三聚氰酸和三聚氰胺。注意：注意：务必选择正确的调谐文件，否则仪器务必选择正确的调谐文件，否则仪器将将无法正确收集您所无法正确收集您所需需要的离子，从而灵敏度要的离子，从而灵敏度低或完全没有响应低或完全没有响应。Time Segments 如果你有多种化合物需要分析，可以根据保留时间不同，分成若干个时间段，每个时间段内只对相应的几种化合物进行采集，有助于提高仪器灵敏度。Delta EMV(+)、DeltaEMV(-)正负模式下，通常会在调谐的 EMV 的基础上，加 200400的 EMV 值，有助于提高信噪比。Div Valve 可以选择 LC 过来的流动相或样品是进入 MS 还是直接去废液。在每个时间段里，可以设置扫描段 Scan Segment，例如以每个化合物为基础。这个信息将传递到定量软件，包括 ISTD。Compound Name 化合物名称 ISTD 是否是内标物 Precursor 母离子 Product Ion 子离子 MS1 Res、MS2 Res 质谱 1 和质谱 2 的分辨率，从高到低分别是 Unit、Wide、Widest，分辨率越低，被分析物被其他离子干扰的可能性越大。Fragmentor 裂解电压，对于源内 CID 和离子传输起作用。通常分子量越大，裂解电压需要设定的越高。Collision Energy 碰撞能量 二级质谱 CID 所离子需要的加速电压，通常在 50V 以下。Dwell 驻留时间 四级杆一次采集特定的离子的时间。在方法编辑界面中可设置 QQQ 的离子源参数，注意下图右侧为 JetStream 的参数画面，这些参数设置可参照 QQQ 快速参考指南。G6460 使用了 Jet Stream 技术，较普通 ESI 增加了 Sheath Gas Temp、Sheath Gas Flow 和 Nozzle Voltage 参数。注意：源参数会显著的影响检测的灵敏度及稳定性，注意：源参数会显著的影响检测的灵敏度及稳定性，Agilent Jet Stream 技术的源参数技术的源参数设置比较复杂，可能需要对源参数进行分别得优化。设置比较复杂，可能需要对源参数进行分别得优化。ESI 源（左边）以及 JetStream 源（右边）参数设置：APCI 源和复合源的设置如下：使用工具栏中的 Save Method 图标或者文件菜单保存方法:8)运行单个运行单个样品样品 1.调用已经编辑好的方法。2.平衡系统。3.打开样品栏，输入样品描述，瓶号以及数据文件名等。4.使用工具栏的 Start Sample Run 图标开始运行，或者运行菜单中的 Interactive Sample 项:9)运行序列样品运行序列样品 工作表是自动进行样品分析的一系列指令。使用工作表，可对每一样品自动进样，并可根据用于该样品的特定方法来采集和分析数据工作表中的每个样品，工作表中的每个样品瓶都可以使用不同的分析方法来进行分析。1.在工作列表面板点击左键 2.如何添加一个样品：从工作列表菜单中选择 Add Sample。工作列表表格就添加了一行新的样品。，直接在工作列表表格输入以下样品信息：样品名称，样品位置，方法，Override DA 方法，数据文件名称，样品类型，注射体积，注释和级别名称等。从工作列表面板可获得更多信息。3.如何添加多个样品：从工作列表菜单选择 Add Multiple Samples。填写 Add Multiple Samples 对话框，给工作列表设定运行信息，样品名称，数据文件名称，调用方法，方法路径以及数据文件储存路径等。点击 Sample Position 标签，如下：选择 Tray 点击并拖动鼠标来确定一个邻近的区域 按住 Control 点击并拖动鼠标，可以选择其不相邻的位置的样品。使用 Shift+Ctrl 在相同地方选择多个样品。点击 OK 关闭 Add Multiple Samples 对话框。指定的样品出现在工作列表表格，并且可以在那里进行再次编辑。4.在工作列表面板点击左键，选择工作列表 Run Parameters 给工作列表设定运行信息，方法路径以及数据文件储存路径。5.建立脚本。如可以在 Post worklist 选择或建立一个 Script，使得 Worklist 在运行完毕后仪器自动切换到 Standby 状态以节约 N2 和流动相。6.使用工具栏的保存工作列表工具或者 File-Save as-Worklist 菜单保存工作列表:7.运行工作表 调出已经编辑好的工作表。平衡系统 使用工具栏上的快捷图标开始运行，或者运行菜单中的 Run-worklist 项:选中特定的样品运行 选择工作表中所有样品 10)定性分析定性分析 1.提取质谱图及扣除背景 双击 Agilent Masshunter Qualitative Analysis 图标：点击 ViewRestore Default Layout 恢复主窗口为默认设置。选择 File Open Data File，打开 MassHunterDataSulfaDrugs 文件夹下的 Sulfamix01.d。按住鼠标左键拖拉鼠标，选择第三个色谱峰的半峰宽，然后点击鼠标右键，选择 Extract Spectram Qualitative Analysis 同样操作，在基线部分，按住鼠标左键拖拉窗口，然后点击鼠标右键，选择 Extract Spectra to Background。在色谱图下面的 Spectrum Results 窗口点击第三个色谱峰的质谱图，然后在该窗口点鼠标右键，选择 Substract Background Spectra。注意 Spectrum Results 窗口的质谱图已经扣除了背景，这对于干扰严重或浓度较低的色谱峰尤其重要。2.提取色谱图 如果要提取色谱图 EIC，需要在谱图上单击右键，选择 Extract Ion Chromatogram，然后在 Type 处选择 EIC，在 m/z Values(s):处输入要提取的质量数或范围，选择 OK 即可 要想提取 UV 色谱图，首先在数据采集中记录 UV 信号，然后打开该数据的 TIC 谱图，在谱图上单击右键，选择 如果在采集谱图时存储了 UV 谱图，可以按照提取质谱图相同的方式，选择一个色谱峰，然后单击右键，在 Type 处选择 Other Chromatogram 即可。提取后的 UV 色谱图如下：如果在采集谱图时存储了 UV 谱图，可以按照提取质谱图相同的方式，选择一个色谱峰，然后单击右键，选择 Extract UV Spectrum 即可（适用于 B02.00 软件以上）要对谱图进行积分，在下图左下角 Chromatogram 处根据不同需要进行计分选择，如积分 UV 谱图，选择 Integrat(UV)，要积分一级质谱，选择 Integrate(MS)等。然后选择执行绿色箭头进行积分。面积列表可以点击来观看。11)定量分析定量分析 本部分基于已经采集到的 MRM 数据来创建批处理和方法，参见下面步骤进行练习：双击 Quantitative Analysis（QQQ）图标，运行定量软件:单击工具栏上“Restore Default Layout”按钮确认主画面恢复为缺省布局。单击菜单项 File New Batch:Quantitative Analysis(QQQ)在新的批处理对话框，找到数据文件夹，例如“D:MasshunterDataDrugOfAbuse”，输入批处理文件名 例如“qqq”并单击 Open 按钮创建一个新的批处理文件：单击菜单项 File Add Samples:在 Add Sample 对话框，单击选择 Select All 按钮然后单击 OK 来添加所有样品：单击菜单 Method New New Method from Acquired MRM Data 用鼠标光标指向文件夹“CMAMCal_L5.d”并选择“Open”按钮导入 MRM 方法采集信息(此处需要选择最优代表性的谱图，一般选择较高浓度样品数据，这样保留时间，离子比例等比较准确)：在左侧 Method SetupTasks 选项下自上而下进行，首先点击 MRM Compound setup 检查导入的用于MRM 化合物设置的采集参数是否正确，指定用于定量的目标离子Traget 和内标 ISTD。单击方法设置任务 Method Setup Tasks Retention Time Setup，检查确认导入的参数（建议在样品分析时尽量按保留时间分组，以免相互干扰）：单击方法设置任务 Method Setup TasksISTD，然后从下拉菜单“ISTD CompoundName”为每个目标化合物指定内标化合物(ISTD），ISTD Conc 列输入相应内标的浓度。单击方法设置任务 Method Setup Tasks Concentration Setup，输入 125 到稀释的最高浓度(Dil.High Conc)；1:5:2:2.5:2 到稀释模式(Dil.Pattern)。确认浓度级别名称。(Level Name Prefix)为 L 且#of Levels 为 5(实际样品分析时如果没有在浓度级别前加前缀，此处可以不必输入 L)，然后选择创建级别(Create Levels)：比较新创建的校正浓度级别、稀释模式（Dilution Pattern）与最高浓度(Dil.High Conc)之间的关系：单击菜单然后复制校正级别到 Method Copy Calibration Levels To 在复制校正级别对话框，单击选择所有（Select All）对话框，然后单击 OK 按钮 浏览方法表（Method Table）比较四个目标化合物“Amp”,“Cocaine”,“Meth”和“MSDA”的校正浓度设置：单击方法设置任务 Method Setup Tasks Qualifier Setup，检查定性离子设置（Check Qualifier setup）参数，在导入 MRM 方法采集参数时定性离子参数自动产生：单击方法设置任务-校正曲线设置 Method Setup Tasks Calibration Curve Setup,检查每个目标化合物曲线拟合（Curve Fit）的缺省设置：单击 Save/Exit Validate 验证方法设置，如果有错误提示，请按照提示进行改正并重新Validate：单击 Save/Exit Exit，然后选择 Yes 应用方法到此批处理表 在工具栏上单击分析批处理（Analyze Batch）图标启动批处理分析。检查显示在批处理表(Batch Table)上的批处理分析结果，化合物信息和校正曲线显示在分析结果的下部：单击 File Save Batch，然后单击 File Close 关闭批处理 产生定量报告，单击 Report Generate 在 Report 画面，选择 Add(不同的软件版本，略有不同)选择一个合适的报告模板 在 Report 画面，单击 Report QueueViewer:等待 Status 为 Done 到原始数据文件夹下，找到 QuantReports 文件夹按照 Batch 名称找到新产生的 Excel 报告。双击打开。6 日常维护与故障排除 4.日常维护日常维护 1)液相的液相的日常维护日常维护（1200，及，及 1290）1.请使用 0.2um 孔隙滤膜过滤流动相和样品。2.水相建议每天更换，避免微生物的滋生；乙腈相每周需要重新过滤一次，去除乙腈自聚合的产物。3.2-3 个月请使用 100%色谱纯的异丙醇过夜冲洗整个系统。4.如果更换了自动进样器的进样盘，请点击自动进样器图标，选择 configuration 进行设置。进样盘设置必须正确，否则会造成自动进样器的损坏。5.排空泵时，如果观察到压力明显升高，请更换 purge 阀中的滤芯。（仅针对 1200，及 RRLC）注意：注意：1200 普通液相普通液相 5ml/min 排空时，典型压力应该小于排空时，典型压力应该小于 5bar；RRLC 5ml/min 排排空时典型压力应该在空时典型压力应该在 10-20bar 间。间。6.如果您使用了 1.8um 填料的色谱柱，请在柱前增加在线过滤器，并且在系统压力明显升高的时候更换在线过滤器内部的滤片。在线过滤器能够延长色谱柱的使用寿命。注意：在线过滤器有最高压力注意：在线过滤器有最高压力600bar和和1200bar两种。请在两种。请在1290系统中使用系统中使用1200bar的在线过滤器。的在线过滤器。7.请正确安装色谱柱和管线接头以保证良好峰形。8.如果需要快速分析，请使用 1.8um 填料的色谱柱，1.8um 填料能够带来更高的理论塔板数，使得分离加速或者峰的分辨率更好。注意注意：如果使用的如果使用的 5.0um 或或 3.5um 的色谱柱，的色谱柱，哪怕使用了哪怕使用了 RRLC 或者或者 1290 液相色谱，液相色谱，此时此时分离效果分离效果仅相当于普通仅相当于普通 HPLC。9.在柱压比较高的情况下，关闭泵以前，建议将流速逐渐降低，以免压力波动过大，破坏色谱柱。10.如果流速低于 0.5mL/min 时，尤其当使用 2.1*50mmRRLC 色谱柱时，请确保：在自动进样器之后使用 0.12mm 内经的红色不锈钢管线，同时确保检测器使用半微量池(5uL)和微量池(2uL)以确保良好峰形，半微量池入口管线也要换成红色不锈钢管线。如需控温，则需要使用低扩散附件（需要订购低扩散工具包，标准配置不含）。当柱温较高时，可以使用低扩散包中的柱后冷却器对流动相降温以保持流动相温度和检测器一致从而获得良好基线。在低流速下要快速变化溶剂梯度，可以使用自动进样器的自动降低延迟体积功能，但要注意此项设置可能增加系统残留。使用 RRLC 在低流速下如果要快速变化系统的溶剂梯度，可以旁路阻尼器和 400uL 混合器（也可以更换 200uL 混合器），以便将系统的延迟体积从 600-800uL 减少到最少 120uL。（仅适合 RRLC）注意：注意：对于不同的应用，正确配置仪器以及使用合适内经的毛细管尤其重要，在下面的配对于不同的应用，正确配置仪器以及使用合适内经的毛细管尤其重要，在下面的配置图中连接端口和毛细管分别标记为（置图中连接端口和毛细管分别标记为（A,B,1 和和 2），按照下图所提供的配置结合您的应用），按照下图所提供的配置结合您的应用进行合里配置，以便充分发挥进行合里配置，以便充分发挥 RRLC 的功能。的功能。（仅对（仅对 1200 系列中的系列中的 RRLC 有效）有效）标准配置连接：标准配置连接：这种配置是标准延迟体积模式（仪器到货时的缺省配置），此配置包括 400ul 混合器和脉冲阻尼器，这种配置一般用于 3.0mm 和 4.6mm 色谱柱或者用于长的 2.1mm 高效色谱柱。中等延迟体积模式：中等延迟体积模式：中等延迟体积模式，这种配置包括 200uL 混合器（随低扩散附件包提供，部件号 G1316-68744，需另外订购），跳过脉冲阻尼器，一般用于 2.1mm，UV 检测和有机相低于 20%的梯度。低延迟体积模式：低延迟体积模式：低延迟体积模式，这种配置跳过混合器和脉冲阻尼器，可以进行快速梯度变换，减少延迟体积，注意，由于减少了混合器合脉冲阻尼器，压力波动较上面两种方式为大。一般用于2.1mm，质谱或 UV 检测。是 RRLC+QQQ 推荐使用方式。6 日常维护与故障排除 2)QQQ 的日常维护的日常维护 1.维护周期表 任务任务 推荐周期推荐周期 检查泵油液面 每周 检查质谱废液桶 每周 打开气镇阀 每周(至少半个小时)清洗离子源 每天 清洗喷雾针 每周 清洗毛细管 3-6 个月 清洗 Ion Optics 每年 更换泵油