从mRNA到蛋白质分子生物学.pptx

Crick的中心法则DNA1957年transcriptiontranslationProteinDNA1970年ReversetranscriptionRNARNAProtein蛋白质是生物信息通路上的终产物，一个活细胞在任何发育阶段都需要数千种不同的蛋白质。活细胞内时刻进行着各种蛋白质的合成、修饰、运转和降解反应。翻译是指将mRNA链上的核苷酸从一个特定的起始位点开始，按每3个核苷酸代表一个氨基酸的原则，依次合成一条多肽链的过程。蛋白质的生物合成 场所：核糖体；模板：mRNA；转移RNA(tRNA)是模板与氨基酸之间的接合体。蛋白质合成需要多种蛋白质、酶和其他生物大分子的参与(50%of the cells dry weight)。蛋白质合成是一个需能反应(80-90%of thecells energy)。遗传密码三联子贮存在DNA上的遗传信息通过mRNA传递到蛋白质上，mRNA与蛋白质之间的联系是通过遗传密码的破译来实现的。遗传密码：mRNA上每3个核苷酸翻译成多肽链上的一个氨基酸，这3个核苷酸就称为一个密码子（三联子密码）。The genetic code is triplet-Key termsCodon is a triplet of nucleotides that represents an aminoacid or a termination signal.Genetic code is the correspondence between triplets inDNA (or RNA)and amino acids in protein.Initiation codon is a special codon (usually AUG)used tostart synthesis of a protein.ORF is an open reading frame;presumed likely to code fora protein.Reading frame is one of three possible ways of reading anucleotide sequence as a series of triplets.Termination codon is one of three (UAG,UAA,UGA)thatcauses protein synthesis to terminate.Polypeptide chains are specifiedby ORF The protein coding region of each mRNA is composedof a contiguous,non-overlapping string of codons calledan opening reading frame(ORF).Each ORF begins with a start codon and ends with astop codon.一个RNA分子可以以三种可能的阅读框进行翻译只有一种阅读框编码实际信息三联子密码及其破译若以3个核苷酸代表一个氨基酸，有43=64种密码子，满足了编码20种氨基酸的需要。(-)(-)(-)一次删去5-GUA UAC GGAU3读码框不变用核苷酸的插入或删除实验证明mRNA模板上每三个核苷酸组成一个密码子。三联子密码的破译 制备E.coli无细胞合成体系，以均聚物、随机共聚物和特定序列的共聚物模板指导多肽的合成。核糖体核糖体结结合技合技术术。1.Cell lysate treated by DNase to preventnew transcriptionE.coli 无细胞蛋白合成体系(cell-free protein synthesizing system)2.Add homopolymeric synthetic mRNAspoly(U)+19 cold (non-labeled)and onelabeled aminoacids3.In vitro translation4.Analyze the translated polypeptides均聚物为模板Nirenberg把多聚（N）作为模板加入到无细胞体系时发现，新合成的多肽链是:poly(U)-UUU-polyphenylalaninepoly(C)-CCC-polyprolinepoly(A)-AAA-polylysinepoly(G)-did not work because ofthe complex secondary structure多核苷酸磷酸化酶:在没有模版的情况下将核苷酸连接起来Poly(UG)-poly(Cys-Val):5UGU GUG UGU GUG UGU GUG3无论读码从U开始还是从G开始，都只能有UGU(Cys)及GUG(Val)两种密码子。随机和特定序列共聚物为模板-By Gobind Khorana 以人工合成的三核苷酸如UUU、UCU、UGU等为模板，在含核糖体、同位素标记的AA-tRNA的适当离子强度的反应液中保温后通过硝酸纤维素滤膜。游离的AA-tRNA因相对分子质量小能自由过膜，与14C标记模板对应的AA-tRNA能与核糖体结合，体积超过膜上的微孔而被滞留。核糖体结合技术-诱捕三核苷酸-by Nirenberg&Leder三核苷酸密码子能使特定的氨基酰-tRNA结合到核糖体上密码子与核糖体相结合的14C标记的氨基酰-tRNAPhe-tRNAPheLys-tRNALysPro-tRNAProUUUAAACCC4.6*0007.70003.1*数字代表特定氨基酰tRNA与带有模板三核苷酸的核糖体相结合的效率。遗传密码的性质1.密码的连续性(commaless)2.密码的简并性(degeneracy)3.密码的普遍性(universality)4.密码的特殊性(specificity)5.密码子与反密码子的相互作用密码的连续性(commaless)三个核苷酸编码一个氨基酸。三联子密码是非重叠(non-overlapping)和连续的(commaless)。密码的简并性(degeneracy)4种核苷酸可组成64个密码子:61个是编码氨基酸的密码子；3个即UAA、UGA和UAG是终止密码子由一种以上密码子编码同一个氨基酸的现象称为简并（degeneracy）通用遗传密码及相应的氨基酸通用遗传密码及相应的氨基酸除色氨酸（UGG）只有一个密码子外，其他氨基酸都有一个以上的密码子：9种氨基酸有2个密码子，1种氨基酸有3个密码子，5种氨基酸有4个密码子，3种氨基酸有6个密码子。同义密码子(synonymous codon)：对应于同一氨基酸的密码子Third base degeneracydescribes the lessereffect on codon meaning ofthe nucleotide present inthe third codon position.突变的影响1.Transition (转换):purine purine orpymidine pymidineAt third position:no effect except forMet (AUG)Ile (AUA,AUC,AUU);Trp (UGG)stop (UGA)At second position:results in similarchemical type of amino acids.2.Transversions (颠换):purine pymidineAt third position:over half have noeffect and result in a similar type ofamino acid.Asp (GAU,GAC)Glu (GAA,GAG)At second positionchange the type ofamino acid.突变的影响In the first position,both transition andtransvertion specify a similar type ofamino acid,and in a few cases it is thesame amino acid(Leu:CUA or UUA).AUG甲硫氨酸及起始密码子GUG缬氨酸及起始密码子UAA终止密码子(Ochre 赭石密码子)UAG终止密码子(Amber 琥珀密码子)UGA终止密码子(Opal)蛋白石密码子）起始密码子和终止密码子密码的普遍性生物界基本共用同一套遗传密码。The standard codons are true for most organisms,but not for all密码的特殊性tRNA的反密码子在核糖体内是通过碱基的 反向配对 与mRNA上的密码子相互作用的。密码子与反密码子的相互作用Codon 5 A C G 3Anticodon 3 U G C 5is usually written as codon ACG/anticodon CGU,ACG and CGU1966年,Crick提出摆动假说(wobble hypothesis)，解释了反密码子中某些稀有成分（如I）的配对，以及许多氨基酸有2个以上密码子的问题。Wobble hypothesis5-anticodon base is able to undergo more movementthan the other two bases and can thus form non-standard base pairs as long as the distancesbetween the ribose units are close to normal.Wobble in base pairingallows G-U pairs toform between thethird base of thecodon and the firstbase of the anticodon.密码子与反密码子的配对前两对严格遵守碱基配对原则第三对碱基有一定的自由度，可以“摆动”，因而使某些tRNA可以识别1个以上的密码子。Base in 5Anticodon in 3Codon一个tRNA究竟能识别多少个密码子是由反密码子的第一位碱基的性质决定的。多个密码子同时编码一个氨基酸，凡是第一、二位碱基不同的密码子都对应于各自独立的tRNA。原核生物中大约有30-45种tRNA，真核细胞中可能存在50种tRNA。为每个三联密码子翻译成氨基酸提供了接合体，tRNA为准确无误地将所需氨基酸运送到核糖体上提供了运送载体。又被称为第二遗传密码tRNAtRNA一级结构(Primary Structure)tRNA二级结构(Secondary Structure)tRNA三级结构(Tertiary Structure)tRNA的功能 长度:60-95 nt (commonly 76)残基:15 个invariant(恒定)和 8个 semi-invariant(半恒定).invariant 和 semi-variant 核苷的位置在二级结构和三级结构中起着重要的作用。tRNA一级结构(primary structure)含有修饰碱基(Modified bases):有时一个tRNA分子的 20%的碱基是经过修饰的。已发现有超过50 种不同类型的修饰碱基。tRNA中所有4种碱基都能被修饰 3个环(loop)tRNA二级结构(secondary structure)不同tRNA在结构上存在大量的共性，由小片段碱基互补配对形成三叶草形分子结构：4条手臂(arm or stem)D loopT loopAnticodon armAcceptor stemD armTC armVariable arm 受 体 臂（acceptorarm）由链两端序列配对形成的杆状结构和3端未配对的34个碱基所组成。其3 端的最后3个碱基序列永远是CCA，最后一个碱基的3或2自由羟基(OH)可以被氨酰化。Amino acid acceptor stemD臂中存在多至3个可变核苷酸位点，17：1及20：1、20：2。最常见的D臂缺失这3个核苷酸，而最小的D臂中第17位核苷酸也缺失了。D-arm and D-loopD臂是根据它含有二氢尿嘧啶(dihydrouracil）命名的。Anticodon loop反密码子臂是根据位于套索中央的三联反密码子命名的。由5bp的臂和7个核苷的环组成。在环中有与密码子互补的由3个核苷组成的反密码子。Variable arm and T-armT（Psi）C臂是根据3个核苷酸命名的，其中表示拟尿嘧啶；由5bp臂和含有GTC的环组成。可变臂(多余臂)是由3到21个核苷组成，可能会形成多达7bp的臂。tRNA的稀有碱基含量非常丰富，约有70余种。每个tRNA分子至少含有2个稀有碱基，最多有19个，多数分布在非配对区，特别是在反密码子3端邻近部位出现的频率最高,且多为嘌呤核苷酸。对于维持反密码子的稳定性及密码子、反密码子间的配对很重要。在L形三级结构中：受体臂顶端的碱基位于“L”的一个端点，反密码子臂的套索状结构生成了“L”的另一个端点。这个结构形式满足了蛋白质合成过程中对tRNA的各种要求而成为tRNA的通式。tRNA的L-形三级结构 tRNA三级结构主要由在二级结构中未配对碱基间形成的9个氢键（三级氢键）而引发的。大部分恒定或半恒定核苷酸都参与三级氢键的形成。tRNA三级结构的形成模板mRNA只能识别特异的tRNA，而不是氨基酸:只有tRNA上的反密码子能与mRNA上的密码子相互识别并配对;氨基酸本身不能识别密码子，只有结合到tRNA上生成AA-tRNA,才能被带到mRNA-核糖体复合物上,插入到正在合成的多肽链的适当位置上。tRNA的功能1.起始tRNA和延伸tRNA2.同工tRNA3.校正tRNAtRNA的种类 起始tRNA:能特异性识别mRNA模板上起始密码子的tRNA;延伸tRNA:其他tRNA统称为延伸tRNA。真核生物起始tRNA携带甲硫氨酸(Met)，原核生物起始tRNA携带甲酰甲硫氨酸(fMet)，原核生物中Met-tRNAfMet必须首先甲酰化生成fMet-tRNAfMet才能参与蛋白质的生物合成。1.起始tRNA和延伸tRNA 同工tRNA：代表相同氨基酸的不同tRNA。2.同工tRNA 在一个同工tRNA组内，所有tRNA均专一于相同的氨酰-tRNA合成酶。同工tRNA既要有不同的反密码子以识别该氨基酸的各种同义密码，又要有某种结构上的共同性，能被AA-tRNA合成酶识别。校正tRNA通过改变反密码子区校正无义突变和错义突变。3.校正tRNA AA-tRNA合成酶是一类催化氨基酸与tRNA结合的特异性酶：AA+tRNA+ATPAAtRNA+AMP+PPi氨酰-tRNA合成酶aminonacyl-tRNA synthetase (ARS )包括两步反应：第一步是氨基酸活化生成氨酰-腺苷酸。AA+ATP+酶（E）E-AA-AMP+PPiAminoacylation (腺苷酰化)of tRNAs第二步是氨酰基转移到tRNA3 末端腺苷残基的2或3-羟基上,生成氨酰-tRNA。E-AA-AMP+tRNAAA-tRNA+E+AMPtRNA-synthetases和charged tRNAs的命名Amino acid:serineCognate tRNA:tRNAserCognate aminoacyl-tRNA synthetase:seryl-tRNA synthetaseAminoacyl-tRNA:seryl-tRNAserAminoacyl-tRNA synthetases遗传密码通过两个接头分子的先后作用得以翻译1.氨酰-tRNA合成酶2.tRNA装料核糖体(ribosome)protein-synthesizing machines核糖体是由几十种蛋白质和多种核糖体RNA(ribosomal RNA,rRNA)所组成的亚细胞颗粒。它像一个沿着mRNA模板移动的工厂，执行着蛋白质合成的功能。一个细菌细胞内约有20,000个核糖体，真核细胞内可达106个。这些颗粒既可以游离状态存在于细胞内，也可与内质网结合，形成微粒体。核糖体及其他组分在大肠杆菌细胞内的分布组分细胞壁细胞膜DNAmRNAtRNArRNA核糖体蛋白可溶性蛋白小分子占细胞总量10%10%2%2%3%21%9%40%3%细胞内数量1213.51031.6105810521041067.5106 真核生物中，大多数正在进行蛋白质合成的核糖体都不是在细胞质内自由漂浮，而是直接或间接与细胞骨架结构有关联或者与内质网膜结构相连的。细菌核糖体大都通过与mRNA相互作用，被固定在核基因组上。核糖体是一个致密的核糖核蛋白颗粒，可解离为两个亚基，每个亚基都含有一个相对分子质量较大的rRNA和许多不同的蛋白质分子。核糖体的结构核糖体是一个大型复合物,由4个RNA和超过80个蛋白质组成2009年诺贝尔化学奖solved the“phase problem”the strong-willed pioneerSSU from Ramakrishnan work withA-site Anticodon Stem Loop boundas well as mRNA analaog show.LSU from Steitz and Moorelabs work shown核糖体的大小亚基Svedberg (S):the unit used to measuresedimentation velocitySedimentation velocity is determined by bothshape and size and hence is not a measure ofmass原核生物核糖体由约2/3的RNA及1/3的蛋白质组成。真核生物核糖体中RNA占3/5，蛋白质占2/5。原核与真核细胞核糖体大小亚基比较EukaryotesProkaryotes大肠杆菌核糖体小亚基由21种蛋白质组成，分别用S1S21表示，大亚基由36种蛋白质组成，分别用L1L36表示。真核生物细胞核糖体蛋白质中，大亚基含有49种蛋白质，小亚基有33种蛋白质，它们的相对分子质量在81034.0104之间。Ribosomal RNA(rRNA)transcription and ribosomal proteins(RPs)expression(actinomycin D or 5-Fluorouracil treament)Processing of pre-rRNA Assembly of ribosomeRibosomal stress and p53 pathwayRibosomal stress results from:p53：人体内最重要的抑癌蛋白NormalStressCaldarola,2009,FEBS Journal核糖体亚基蛋白调控HDM2-p53信号通路p53 信号通路(Chakraborty et al.,2011,Wiley Interdiscip Rev)核糖体亚基蛋白RPs-HDM2-p53通路RPs-MDM2(HDM2)-p53 pathway(Deisenroth and Zhang,2010,Oncogene)10acute myeloid leukemiaBlood,2010,115:3196-3205Simplified schematic of eukaryoticribosome biogenesisacute myeloid leukemiaBone marrow failureSize comparisons show that the ribosome islarge enough to bind tRNAs and mRNA.核糖体分子中可容纳两个tRNA和约40bp长的mRNA。核糖体结构模型In cells,the small and large ribosomesubunits associate with each other andthe mRNA,translate it,and thendissociate after each round of translation.This sequence of association anddissociation is called the ribosome cycle.Ribosome cyclesOverview of the events of translation/ribosome cycleThe large and the small subunits undergone associationand dissociation during each cycle of translation真核生物细胞中发现的多聚核糖体(polyribosomes or polysomes)现象大大加速蛋白质合成的速度，提高了mRNA的利用率。电镜下的多聚核糖体(polysomes)1.2.3.4.5 S rRNA16 S rRNA23 S rRNA5.8 S rRNArRNA另一个区域含有保守序列GCGCCGAAUGGUAGU，与23S rRNA的中一段序列互补，可能是5 S rRNA与50 S核糖体大亚基相互作用的位点。5S rRNA细菌5 S rRNA含有120个核苷酸（革兰氏阴性菌）或116个核苷酸（革兰氏阳性菌）。5S rRNA有两个高度保守的区域:一个区域含有保守序列CGAAC，这是与tRNA分子TC环上的GTCG序列相互作用的部位，是5 SrRNA与tRNA相互识别的序列。长约1 4751 544个核苷酸之间 含有少量修饰碱基 位于原核生物30 S小亚基内 结构十分保守:(1)3端一段ACCUCCUUA的保守序列，与mRNA5端翻译起始区中的SD序列互补。(2)靠近3 端处还有一段与23 S rRNA互补的序列，在30 S与50 S亚基的结合中起作用。16S rRNArRNA可能与tRNAMet的结合有关。第143157位核苷酸之间有一段12个核苷酸的序列与5 S rRNA上第7283位核苷酸互补，表明组成50 S大亚基的这两种RNA之间可能存在相互作用。23S rRNA23 S rRNA基因包括2904个核苷酸:第19842001核苷酸之间存在能与tRNAMet序列互补的片段,表明核糖体大亚基23 S 真核生物核糖体大亚基特有的rRNA 长度为160个核苷酸 含有修饰碱基 含有与原核生物5 S rRNA中的保守序列CGAAC相同的序列，可能与tRNA作用的识别有关。5.8S rRNA核糖体RNA决定核糖体的整体形状核糖体上重要位点核糖体小亚基小亚基负责对模板mRNA进行序列特异性识别，大亚基负责携带氨基酸及tRNA的功能，肽键的形成、AA-tRNA、肽基-tRNA的结合等主要在大亚基上。去氨酰-tRNA肽基酰-tRNA氨酰-tRNA A位点(aminoacyl site),新到来的氨酰-tRNA的结合位点;P位点(peptidyl site),肽酰-tRNA结合位点;E位点(Exit site),释放去氨酰-tRNA的位点。核糖体上重要位点 只有fMet-tRNAfMet能与第一个P位点相结合，其它所有tRNA都必须通过A位点到达P位点，再由E位点离开核糖体。每一个tRNA结合位点都横跨核糖体的两个亚基，位于大、小亚基的交界面。Location of tRNAsCate et al.,Science 1999Channels for mRNA entering andexiting are located in the small subunitThere is a pronouncedKink（扭结）（扭结）in the mRNAbetween the two codonsat P and A sites.Thiskink places the vacant Asite codon foraminoacyl-tRNAinteraction.EPAmRNA14 AngstromsChannel for polypeptide chain exitinglocates in the large subunitrRNAThe size of the channelonly allow a very limitedfolding (helix)of thenewly synthesizedpolypeptide.Ribosomal protein50 S subunit谢 谢!