水飞蓟宾对利福平和异烟肼致...体Ntcp与Bsep的影响_许雪飞.pdf

解剖学研究2023年第45卷第1期Anat Res,2023,Vol.45,No.1【摘要】目的初步探讨水飞蓟宾能否通过激动Nrf2/ARE信号通路，激活下游胆汁酸相关的转运体牛磺胆酸钠转运蛋白（Ntcp）及胆盐输出泵（Bsep）Bsep的表达，从而改善异烟肼/利福平（INH/RFP）INH/RFP引起的肝损伤。方法：选用SPF级ICR小鼠随机分成5组：对照组（CON组），模型组（IR组），水飞蓟宾干预组（SY50组，SY100组，SY200组），除对照组外，干预组及IR组根据体质量给予75 mg/kgINH+150 mg/kgRFP，对照组给予空白溶剂，干预组分别同时给予水飞蓟宾低剂量50 mg/kg（IR+SY50），中剂量100 mg/kg（IR+SY100）以及高剂量200 mg/kg（IR+SY200），连续灌胃给药14 d。第15天给予异氟烷吸入麻醉后摘眼球取血，离心后用于生化指标测定，取脏组织于10%福尔马林固定用于病理切片、HE染色；4%多聚甲醛固定用于目标蛋白免疫组化测定；Western blot测定目标蛋白Ntcp、Bsep及核Nrf2的表达。结果与CON组相比，IR组均能够引起生化指标ALT、AST、TBil、DBil、ALP、TBA的显著变化，与IR组相比，低剂量的水飞蓟宾干预组ALT、Tbil、TBA降低明显，中剂量的水飞蓟宾能显著降低ALT、AST、Tbil、TBA，高剂量的水飞蓟宾能显著降低除ALP以外的所有指标，差异有统计学意义（P0.05）。IR组Ntcp，Bsep蛋白表达均下调，而水飞蓟宾能显著上调这些蛋白的表达，IR组下调Nrf2核蛋白的表达，与水飞蓟宾合用后，Nrf2核蛋白的表达显著上调。结论水飞蓟宾可能通过激活Nrf2入核，调控下游胆汁酸转运体Ntcp、Bsep的表达，治疗INH/RFP引起的肝损伤。【关键词】异烟肼；利福平；药物性肝损伤；Nrf2/ARE信号通路；水飞蓟宾；牛磺胆酸钠转运蛋白；胆盐输出泵基金项目：广东省医学科学技术研究基金（A2019094），广东省中医药局科研项目（20202108）DOI：10.20021/ki.16710770.2023.01.06Effects of silybin on bile acid transporters Ntcp and Bsep in liver injury induced by rifampicin and isoniazidvia Nrf2/ARE signal pathwayXU Xuefei1，LIN Yingyao1，CHEN Mingzhen1，HE Guansheng1，CHEN Juan1，LI Hui1，PENG Wenxing2，WANGRuolun11Department of Pharmacy，The Second Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University，Guangzhou，GuangdongProvince 510260，China；2Institute of Clinical Pharmacy，Xiangya Second Hospital，Central South University，Changsha，Hunan Province 410011，ChinaCorresponding author：WANG Ruolun，Email：【Abstract】ObjectiveTo explore whether silybin can activate the expression of bile acid related transporters the Sodiumtaurocholate Cotransporting Polypeptide（Ntcp）and the Bile Salt Export Pump（Bsep）by activatingNrf2/ARE signal pathway，so as to improve the liver injury caused by isoniazide/rifampicin.MethodsSPF ICRmice were randomly divided into 5 groups：control group（CON group），model group（IR group）and silybin intervention group（SY50 group，SY100 group and SY200 group）.In addition to the control group，the intervention groupand IR group were given 75 mg/kg INH+150 mg/kg RFP according to body weight，the control group was given blanksolvent，and the intervention group was given silybin 50 mg（IR+SY 50），100 mg（IR+SY100）and 200 mg（IR+SY200）respectively for 14 days.On the 15th day，after isoflurane inhalation anesthesia，eyeball blood was taken，centrifuged for biochemical index determination，and liver tissue was fixed in 10%formalin for pathological sectionand HE staining；4%paraformaldehyde was fixed for immunohistochemical determination of target protein；the expres水飞蓟宾对利福平和异烟肼致肝损伤中胆汁酸转运体Ntcp与Bsep的影响许雪飞1，林迎瑶1，陈铭臻1，何关生1，陈娟1，李慧1，彭文兴2，王若伦11广州医科大学附属第二医院药学部，广东广州510260；2中南大学湘雅二医院临床药学研究所，湖南长沙410011通讯作者：王若伦，Email：论著34解剖学研究2023年第45卷第1期Anat Res,2023,Vol.45,No.1sions of target proteins Ntcp，Bsep and Nrf2 were determined by Western blot.ResultsCompared with the controlgroup，the IR group could cause significant changes in biochemical indexes ALT，AST，Tbil，Dbil，ALP and TBA.Compared with the model group，the ALT，Tbil and TBA in the lowdose silybin intervention group decreased significantly，Medium dose silybin could significantly reduce ALT，AST，TBIL and TBA，and high dose silybin could significantly reduce all indexes except ALP（P0.05）.The expression of Ntcp，Bsep and nuclear Nrf2 protein were downregulated in the IR group，while silybin could significantly upregulate the expression of these proteins compared withthose in the IR group.ConclusionSilybin may regulate the expression of downstream bile acid transporters Ntcpand Bsep by activating Nrf2 into the nucleus to treat liver injury caused by INH/RFP.【Key words】Isoniazid；Rifampicin；Drug induced liver injury；Nrf2/ARE signal pathway；Silybin；Sodiumtaurocholate cotransporting polypeptide（Ntcp）；Bile salt export pump（BSEP）抗结核药引起的肝损伤发病机制复杂，往往是多种机制先后或共同作用的结果1，迄今尚未充分阐明。肝脏中 Nrf2/ARE 是肝细胞最主要的保护信号通路，一方面 Nrf2/ARE 通路的激活能调控下游与细胞解毒相关的抗氧化蛋白及细胞转运体的表达及活性2，从而增强肝脏对多种刺激信号的反应及调节作用，多项研究证明牛磺胆酸钠转运蛋白（Sodiumtaurocholate cotransporting polypeptide，Ntcp）、胆盐输出泵（Bile salt export pump，Bsep）、Mrp2、Bcrp 等与内源性物质及胆汁酸摄入及外排起重要作用的蛋白是Nrf2信号通路的下游的重要功能蛋白36。水飞蓟宾为水飞蓟主要的活性成分，治疗肝胆疾病已有千年历史，被称为“天然的保肝药”。有研究报道水飞蓟宾可以拮抗肝细胞坏死、稳定细胞膜结构及代谢、促进肝功能的恢复。但是目前的机制尚不足以解释水飞蓟宾如何改善抗结核药物性肝损伤（Antituberculosis druginduced liverinjury，ATLI）的胆汁淤积现象。本研究试图探讨水飞蓟宾对 ATLI 小鼠 Nrf2/ARE 通路及下游调控蛋白Ntcp、Bsep的作用机制。1材料与方法1.1材料1.1.1实验动物SPF 级 4 周龄雌性成年 ICR 小鼠（体质量2630 g），购于广东省医学实验动物中心，适应性喂养2周；动物生产许可证：SCXK（粤）20110003；动物实验研究方案经广州医科大学附属第二医院医学伦理委员会批准（伦理审查编号：A2020042）。1.1.2主要药品与试剂异烟肼、利福平均为生物技术级（含量 98%以上）（上海麦克林生化科技），水飞蓟宾（北京中科质检生物）、Nrf2一抗（美国 Proteintech），Ntcp（Rabbit）、Bsep（Rabbit）（Invitrogen），等。1.2方法1.2.1动物分组及给药将ICR 小鼠（ICR mouse）随机分为5组，除CON组外，IR组及干预组根据体质量每日给予 75 mg/kgINH+150 mg/kg RFP，对照组根据体质量给予空白溶剂，干预组分别给予水飞蓟宾低剂量 50 mg/kg（IR+SY50）、中剂量 100mg/kg（IR+SY100）以 及 高 剂 量 200 mg/kg（IR+SY200），连续灌胃给药14 d。1.2.2生命体征观察于给药次日称量小鼠饲料剩余量，记录小鼠食量，观察其生长情况，毛色，大小便，食欲，行动，对外界刺激反应。1.2.3血样及组织样本采集第15天将小鼠以异氟烷吸入麻醉，摘除眼球取血，置于离心管中，离心，取上清。然后处死小鼠，取肝脏组织。1.2.4小鼠血清生化检测去血清约 250 L，用全自动生化分析仪检测血 ALT、AST、DBil、TBil、TBA和GLP的水平。1.2.5组织病理学检查取实验动物相同部位的肝脏组织，置于10%福尔马林固定。经乙醇脱水、二甲苯透明、石蜡包埋、人工切片、苏木精伊红（HE）染色、光学树脂封片后，光学显微镜下对病理组织进行形态结构的观察，由病理科病理专家分别对病理切片进行评估。1.2.6Western blot 检测肝组织中 Nrf2、Ntcp、Bsep蛋白的表达用 RIPA 裂解液提取肝组织总蛋白。蛋白样品经 SDSPAGE 分离后转移到聚偏二氟乙烯膜上。膜置于5%脱脂奶粉摇床室温封闭，洗涤，分别用 Ntcp（0.2 g/mL）、Bsep（0.2 g/mL）和 Nrf2（1 1000）一抗4摇床上孵育过夜，次日膜35解剖学研究2023年第45卷第1期Anat Res,2023,Vol.45,No.1表1药物对各实验组小鼠体质量变化的影响（MeanSD）时间（d）147101315CON组27.542.6629.601.6731.861.8433.11.9534.472.2636.532.35IR组27.670.8428.670.7131.980.9833.761.8134.721.7637.682.37SY50组27.121.7827.612.0330.701.6332.431.6933.841.9235.662.17SY100组26.611.3427.121.7929.611.7431.691.6832.631.6734.811.55SY200组28.951.8228.472.2131.352.1033.172.4633.642.3535.652.23经洗涤过后于摇床上室温孵育二抗（1 5000），采用 ECL 显色试剂在暗盒内与 X 线胶片曝光 160min；显影成像。1.2.7Western blot检测肝组织中核蛋白Nrf2的表达采用 CER 试剂冰上裂解组织后，离心取得细胞核的粗制品，然后再加入 NER，震荡重悬，反复步骤后用Suspension Buffer重悬细胞核。蛋白样品经 SDSPAGE 分离后转移到 NC 膜上。膜置于 5%脱脂奶粉室温封闭，洗涤，用Nrf2（1 1000）和内参PCNA（1 5000）一抗4摇床上孵育过夜，次日膜经洗涤后室温孵育二抗（1 5000），采用 ECL 显色试剂在暗盒内与X线胶片曝光160 min；显影成像。1.2.8免疫组化染色肝组织样本经过石蜡包埋、切片、烤片，脱蜡至水等前期处理步骤后，将切片进入0.01 mol/L枸橼酸盐缓冲液中，微波炉加热至沸腾，热修复抗原冷却至室温后，加入 3%高碘酸，于室温放置 10 min 使内源性酶灭活。PBS 冲洗后滴加稀释的 Ntcp（1 200）或 Bsep（1 200）一抗，4过夜。孵育二抗（50100 L抗兔IgG抗体HRP多聚体）30 min，PBS冲洗3遍后，滴加预制好的显色剂 DAB 工作液，室温孵育 15 min，苏木精复染，PBS返蓝，最后各级酒精（60%100%）脱水，取出后置于二甲苯10 min，2次，中性树胶封片，显微镜观察。1.3数据统计与分析所测相关指标中计量资料均用均值标准差（MeanSD）表示。所有数据用 SPSS25.0 进行统计学分析，多组间的比较采用单因素方差分析（oneway ANOVA）来检验，以 P0.05 为差异有统计学意义。2结果2.1小鼠生长状态实验中考察了小鼠各组在给药前、建模及干预组中随着时间推移体质量变化。CON组小鼠体质量生长速度较稳定，各实验组小鼠在 1 周左右的时间体质量增加，而在 10 d 以后体质量增长较缓慢。IR 组小鼠毛色变暗，无光泽，小鼠有前后脚掌及尾部呈橘红色，大小便均可见橘红染。干预组 SY50 组部分实验小鼠出现上述症状，SY100和SY200组则无明显改变。2.2血清生化指标变化为了评价水飞蓟宾对 IR 诱导的肝损伤模型小鼠中的保护作用，对肝生化指标进行了分析，如表 1 所示。与 CON 组相比，IR 组各项指标均显著升高，当联合水飞蓟宾治疗后，低剂量的水飞蓟宾明显降低 ALT、TBil、TBA 水平中剂量的水飞蓟宾能显著降低ALT、AST、TBil、TBA，高剂量的水飞蓟宾能显著降低除 ALP 以外的所有指标，差异有统计学意义（P0.05）。2.3水飞蓟宾对肝损伤模型小鼠肝组织影响CON 组肝细胞排列整齐，细胞形态并未发现变化，与 CON 组相比，IR 组出现细胞见中度羽毛状脂肪变性，点灶样坏死，组织形态学变化显著。与水飞蓟宾合用后，干预组组织形态学有所改善，肝细胞排列良好，显微镜下见少许轻度炎症及细胞坏死，脂肪变性（图1）。2.4水飞蓟宾对肝损伤模型小鼠肝组织中胆汁酸转运体Ntcp、Bsep蛋白表达的变化2.4.1Ntcp、Bsep蛋白的免疫组化染色结果为了研究水飞蓟宾对INH/RFP致肝损伤模型的保护机制，我们检测了与胆汁稳态相关的转运蛋白Ntcp、Bsep 的表达，通过免疫组化对两个蛋白的表达进行定性及定位分析，阳性染色为黄色或棕黄色染色，结果如图 2、3 所示。Ntcp、Bsep 主要在细胞膜上表达，Bsep 在胞浆中也有少量表达。统计学分36解剖学研究2023年第45卷第1期Anat Res,2023,Vol.45,No.1表1药物对各组小鼠肝生化指标的影响（MeanSD）CON组IR组IR+SY50组IR+SY100组IR+SY200组ALT（U/L）28.708.3047.407.70*28.609.6329.336.3426.373.42AST（U/L）110.8017.52193.8024.59*177.4031.22125.6745.80131.8723.44TBil（mol/L）2.710.739.121.09*5.840.744.330.984.552.35DBil（mol/L）1.090.353.820.74*3.201.802.920.552.611.35ALP（U/L）95.5016.63200.2074.36*142.6035.73173.5051.32162.5045.82TBA（mol/L）0.820.5710.644.26*2.961.382.581.163.581.16注：与CON组比较，*P0.05；与IR组比较，P0.05析显示，INH/RFP 可显著降低 Ntcp、Bsep 的表达，而用水蓟宾干预后，这两个蛋白的表达均显著上调，差异有统计学意义（P0.05）。2.4.3Ntcp、Bsep和Nrf2核蛋白表达的变化Western blot检测及定量分析水飞蓟宾对INH/RFP小鼠肝损伤模型中 Ntcp、Bsep 的表达结果如图 46 所示。蛋白表达条带图及统计学分析显示，INH/RFP 可以显著降低 Ntcp 及Bsep 蛋白表达，而用水飞蓟宾干预后，这 2 个因子的蛋白表达均显著上调，差异有统计学意义（P0.01）。图1水飞蓟宾对肝损伤模型小鼠肝组织结构的影响（HE染色，bar=100 m）A.对照组；B.IR组；C.SY50组；D.SY100组；E.SY200组BACEDDEFABC#*0.070.060.050.040.030.020.100Optical Density for NtcpCONIRSY50SY100SY200图 2水飞蓟宾对肝损伤模型小鼠肝组织中胆汁酸转运体 Ntcp 的影响（免疫组化染色，bar=25 m）A.对照组；B.IR组；C.SY50组；D.SY100组；E.SY200组；F.光密度值。*与CON组比较，*P0.05；与IR组比较，#P0.0537解剖学研究2023年第45卷第1期Anat Res,2023,Vol.45,No.1图3水飞蓟宾对肝损伤模型小鼠肝组织中胆汁酸转运体Bsep的影响（免疫组化染色，bar=25 m）A.对照组；B.IR组；C.SY50组；D.SY100组；E.SY200组；F.光密度值。*与CON组比较，*P0.05；#与IR组比较，#P0.05CEDAB#*CONIRSY50SY100SY2000.080.070.060.050.040.030.020.010Optical Density for BsepNrf2信号通路在维持全身胆汁酸稳态和抑制氧化应激发挥了重要作用。INH/RFP 显著下调核蛋白Nrf2表达，合用水飞蓟宾后，各组Nrf2核蛋白表达均上调，差异有统计学意义（P0.05）图 5、图6。3讨论针对 INH/RFP 联用引起的肝损伤的机制主要有肝细胞损伤、胆汁淤积等，有研究显示药物及胆汁酸有关的转运体的表达及活性改变与肝内胆汁淤积的发生发展密切相关78。肝细胞基底膜和胆管侧膜上的转运体对维持正常的胆汁流和肝脏功能起着重要作用。Ntcp 和 Bsep 是其中两个最重要的胆盐转运蛋白，其调节原则是维持肝细胞内胆汁酸浓度在较低的水平以尽量减少其潜在的细胞毒性，Bsep 则是实现这一目标的关键，胆汁酸在小管膜上流出，驱动胆汁酸的肝肠循环。Ntcp 则以钠依赖的方式调节基底外膜上胆汁酸的摄取910。Ntcp和Bsep在维持胆汁酸稳态起着重要的作用，本文从这一方向出发，在前期结果利福平、异烟肼合用能显著抑制胆汁酸转运体 Ntcp、Bsep 的蛋白表达，且小鼠肝损伤的血清生化指标与病理组织学的变化明显滞后于转运体的显著变化的基础之上11，研究水飞蓟宾这一经典的轻、中度药物性肝损伤的治疗药物对Ntcp、Bsep蛋白表达影响，通过实验研究发现，水飞蓟宾能够显著上调Ntcp、Bsep 的表达，从而改善药物性肝损伤胆汁淤积的症状。本研究中INH/RFP下调Ntcp的表达也有可能是身体的一种代偿反应，而与水飞蓟宾合用后Ntcp 能恢复，这可能更加有利于胆汁酸稳态的图4各组小鼠肝组织总蛋白中Ntcp、Bsep蛋白表达变化（Western blot检测）ConIRSY50SY100SY200NtcpBsepactinConIRSY50SY100SY200Nrf2（核）PCNA图 5各组小鼠肝组织核蛋白中 Nrf2 蛋白表达变化（Western blot检测）ConIRSY50SY100SY2000.90.80.70.60.50.40.30.20.10*NtcpBsepNrf2（核）*#图 6水飞蓟宾对小鼠肝损伤模型中 Ntcp、Bsep 和 Nrf2核蛋白表达水平的变化。*与 CON 组比较，*P0.05；与 IR 组比较，#P0.0538解剖学研究2023年第45卷第1期Anat Res,2023,Vol.45,No.1恢复。Nrf2 是众所周知的氧化应激转录因子，在应激条件下，Nrf2与keap1因子结合并易位到细胞核中，与反应元件 ARE 识别后刺激目的基因的表达12。在近几年的研究中表明，Nrf2 介导的适应性反应在药物性肝损伤中发挥着非常重要的作用1314，有研究显示在石胆酸诱导的胆汁淤积的改善可能是由于Nrf2介导的胆汁酸转运体MRP2、MRP3、MRP4的上调有关13。然而，关于适应性反应对异烟肼、利福平诱导的细胞损伤的机制知之甚少。有研究指出利福平能降低细胞Ntcp、Bsep、MDR1、MRP2、OATP2 的 mRNA 的表达，而诱导NRF2 基因的表达则能够起到相反的效果15。本实验中异烟肼、利福平合用能够显著下调细胞核中 Nrf2 的蛋白的表达，而水飞蓟宾能够显著上调Nrf2 核蛋白的表达，说明水飞蓟宾在诱导 Nrf2 入核的基础上，能上调Ntcp、Bsep的蛋白的表达可能是通过 Nrf2 这一信号通路调控的，提示 Nrf2ARE信号通路可作为临床防治药物性肝损伤的一个潜在的靶点。关于Nrf2与水飞蓟宾在INH/RFP诱导肝损伤调节 Ntcp、Bsep 表达的具体机制有待进一步研究。作者贡献声明许雪飞负责科研设计、数据分析整理、论文撰写及修改；林迎瑶、李慧负责资料整理及数据分析；陈铭臻负责科研设计、实验实施、数据收集及协助；何关生、陈娟负责查阅文献及协助文章审阅；彭文兴和王若伦负责科研设计、实验技术指导及论文审阅利益冲突声明所有作者声明，在课题研究和文章撰写过程中不存在利益冲突，课题经费支持没有影响文章观点和对研究数据客观结果的统计分析及其报道机构伦理问题动物实验研究方案经广州医科大学附属第二医院医学伦理委员会批准（伦理审查编号A2020042）参考文献1Metushi I，Uetrecht J，Phillips E.Mechanism of isoniazidinduced hepatotoxicity：then and nowJ.Br J Clin Pharmacol，2016，81（2）：10301036.2John P，Kale PP.Prominence of oxidative stress in themanagement of antituberculosis drugs related hepatotoxicity J.Drug Metab Lett，2019，13（2）：95101.3Yang Y，Liu L，Zhang X，et al.Tanshinone IIA prevents rifampicininduced liver injury by regulating BSEP/NTCP expression via epigenetic activation of NRF2J.Liver Int，2020，40（1）：141154.4Campbell MR，Karaca M，Adamski KN，et al.Novel hematopoietic target genes in the NRF2mediated transcriptional pathwayJ.Oxid Med Cell Longev，2013，2013：120305.5Singh A，Wu H，Zhang P，et al.Expression of ABCG2（BCRP）is 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