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人脂肪干细胞结合微载体在生物反应器中向软骨细胞分化
【摘要】 ［目的］探索在旋转生物反应器内，应用微载体技术快速扩增并向软骨分化人脂肪干细胞。［方法］将人脂肪干细胞结合Cytodex3微载体在旋转的生物反应器内进行动态培养，应用倒置显微镜和扫描电镜对微载体表面的脂肪干细胞进行动态观察，并对收获的脂肪干细胞进行SafraninO、toluidine blue染色等组织化学染色及Ⅱ型胶原的免疫化学染色分析。［结果］脂肪干细胞于24 h内贴附于Cytodex3微载体表面，细胞形态为短梭形，随时间的延长，贴附于微载体的细胞逐渐增多，到培养后期，细胞密度可达最初接种的19倍左右，在微载体上收获的细胞进行番红花O、阿利新蓝染色呈阳性，Ⅱ型胶原染色阳性，均强于对照组。［结论］利用微载体细胞培养技术可简便快速地在体外扩增脂肪干细胞，并成功实现向软骨细胞分化。
【关键词】 脂肪干细胞； 生物反应器； 微载体； 软骨细胞
　自从2001年Zuk等人［1］从脂肪中提取出了具有多向分化潜能的干细胞后，脂肪干细胞(adipose derived stem cells,ADSCs)以其来源广泛，取材方便，扩增迅速等优点迅速成为了组织工程的研究热点。多项研究证实，ADSCs在体外可以向多种细胞系分化，包括骨、软骨、脂肪、肌肉、神经及内皮［２、3］。其生物学特性与骨髓基质干细胞非常相似，在组织工程领域颇具应用前景。而软骨是公认的最适于应用组织工程技术构建的组织，因此以ADSCs作为软骨组织工程的种子细胞，具有很高的实用价值。构建组织工程软骨通常要求短期内获得大量的种子细胞，并且在体外培养过程中能够保持良好的表型。传统的静态培养方式很难满足这些要求，而立体三维动态培养不但可以加速细胞的增殖，而且利于软骨方向分化及表型的维持［４］。因此，本研究利用生物反应器技术结合微载体对ADSCs进行快速扩增同时向软骨细胞方向诱导，旨在观察ADSCs在微载体上增殖分化情况，探讨其未来临床应用的可行性。
　　1 材料和方法
　　材料
　　Ⅰ型胶原酶，地塞米松，2磷酸1抗坏血酸，ITS，Cytodex 3(Sigma)，胰酶，高糖DMEM(Gibco)，胎牛血清(元亨圣马)，FGF2、TGFβ1(Peprotech,UK),Ⅱ型胶原鼠抗人单克隆抗体(北京中山公司)，旋转生物反应器(Synthecon)，Olympus倒置显微镜(Olympus)。
　　方法
　　ADSCs的分离培养 取膝关节置换术中切除的髌下脂肪垫，严格保持无菌，取材后30 min内进行干细胞分离。在超净工作台中，用显微剪刀仔细剔除脂肪组织表面的筋膜和小血管，DHank‘s冲洗3遍以洗去红细胞的污染。剪碎，加入5倍体积的%的Ⅰ型胶原酶，37℃、搅拌30 min，离心2 000 r/min，5 min，倾去上层脂肪及上清，DHank‘s洗涤，100目筛网过滤。离心1 000 r/min 5min，沉淀用DHank‘s洗2遍，将细胞重悬于含10%FBS的高糖DMEM培养基，48 h后换液。细胞长满80%后，用%胰酶消化传代培养。至第2代时，换培养液为软骨诱导液(5 ng/ml FGF2,10 ng/ml TGFβ１，50 μg/ml Vc、10-7M Dexamethasone,1xITS)进行软骨方向诱导分化。
　　Cytodex 3预处理 取干重微载体珠50 mg，放入10 ml的洁净玻璃瓶中。向瓶中加入不含钙和镁离子的PBS 10 ml，室温下至少孵育3 h以膨胀微载体珠，用巴氏吸管弃去上清液，PBS清洗微载体2次，弃去PBS，再加入新鲜不含钙和镁离子的PBS 10 ml，高压灭菌20 min，吸除上清液，微载体用培养液清洗，置于4℃冰箱中备用。
　　细胞培养方式 将Cytodex 3微载体50 mg及ADSCs(最终浓度1×105/ml)加入到10 ml体积的RCSS培养容器中，并补加软骨诱导培养基至充满容器。把接种细胞的容器连接于旋转底座。整个装置放于5%CO2孵箱，于37℃常规条件下培养。开始以5 r/min的速度旋转5 min，以充分混合细胞，然后停止旋转5 min。再旋转容器5 min，再停止容器旋转5 min。多次重复循环，最后持续旋转容器并逐步调整转速至10～12 r/min。视培养基颜色及pH值决定是否换液及换液量。ADSCs静止培养是以1×105/ml接种于6孔板中，每孔2 ml，接种5孔，培养过程中每2～3 d更换培养液，保持细胞供养充足。
　　细胞形态学观察和计数 人ADSCs分别培养1、3、5、7 d，取样本于倒置显微镜下观察微载体表面ADSCs生长形态及增值变化情况，消化、分离微载体表面的软骨细胞并用血细胞计数板计数，描记细胞培养生长曲线。并取第3 d细胞微载体样本，进行扫描电镜观察，观察细胞生长形态及基质分泌情况。对照组静态单层培养的ADSCs细胞，分别于1、3、5、7 d观察细胞生长形态及增值变化情况，并收集一孔细胞计数，描记细胞生长曲线。
　　细胞化学及免疫细胞化学分析分别将微载体上生长的ADSCs和单层培养的ADSCs进行消化收集，爬片，应用SafraninO染色，toluidine blue染色观察细胞外基质中GAG合成和分泌情况。应用Ⅱ型胶原单克隆抗体与细胞爬片共同孵育，以DAB为底物应用免疫过氧化物酶法显色，阳性染色为棕色反应，观察Ⅱ型胶原分泌合成情况。
　　2 结果
　　ADSCs在Cytodex 3微载体表面贴附生长情况
　　细胞接种3 h后，细胞开始贴附于微载体表面，24 h后，绝大部分细胞已经贴附在微载体表面，培养基中仅可见少量死亡细胞。细胞由球形、半球形逐渐伸展为短梭形，偶见伪足伸出，形态不规则(图1a)。第3 d，微载体表面细胞明显增多，在不同焦距平面上均可见细胞贴附生长，细胞周围可见基质分泌沉淀，微载体间偶见细胞连接。细胞形态呈短梭形扁平状。培养基中少见死亡细胞，电镜扫描，细胞在微载体表面贴附良好(图1b)。第5 d，微载体大部分空间已被细胞所覆盖，细胞层叠生长，大量基质分泌，单个细胞形态不易区分，微载体之间可见宽大的细胞连接体，微载体呈团状生长(图1c)。第7 d，微载体已被完全覆盖，表面细胞互相重叠呈团块状，这使得微载体表面变得粗糙、凹凸不平。微载体间广泛存在细胞连接，培养基中几乎无脱落细胞(图1d)。
　　ADSCs在静态培养中生长情况
　　细胞接种于诱导培养基2 h后，开始贴壁，24 h后全部贴壁。细胞形态为短梭形或多角形，与未诱导ADSCs相比较细胞个体略大。完全贴壁后即开始快速增殖，3 d达到50%融合，5 d达到80%融合。随细胞密度增加，增值速度减慢，7 d基本完全融合。
　　2种不同培养方式下ADCSs的生长曲线
　　在第1、3、5、7d，分别从RCCS容器及普通培养瓶中收集ADSCs并计数，做生长曲线如图2。台盼蓝染色排除试验显示，从微载体上回收ADSCs存活率90%以上。血细胞计数板计数，可见ADSCs于RCSS接种后的第3 d起生长加速，至第7 d细胞密度达到最高值，约为最初接种的19倍。静态单层培养第7 d收获细胞总数约为最初的6倍余。
　　细胞化学及免疫细胞化学检查分析
　　2组不同培养方式的ADSCs爬片染色显示，微载体培养的细胞SafraninO染色，toluidine blue染色呈强阳性，强于静态培养组，表明细胞外基质中含有大量GAG；Ⅱ型胶原染色亦呈强阳性。结果表明微载体上培养的ADSCs经过动态诱导培养，有软骨特征性基质成分表达(图3～5)。

　　3 讨论

　　脂肪来源干细胞容易获得，并且来源广泛，与骨髓基质干细胞一样均属于来自中胚层的成体干细胞。De Ugarte等［5］发现来源于骨髓和脂肪组织的干细胞在细胞获得率、细胞老化、基因转染和细胞的黏附特性等方面没有明显的差别。因此，ADSCs作为软骨组织工程的种子细胞，具有不可多得的优势和前景。
　　作为临床应用，构建组织工程软骨往往需要大量的种子细胞，有研究表明当细胞数量少于1×107/ml时就不能形成软骨或生成很少［6］。传统的培养方式不仅扩增速度慢，而且不容易维持干细胞诱导后的表现；在三维培养条件下则有利于ADSCs向软骨方向分化，并促进细胞外基质的合成［7］；而动态三维立体培养则进一步提高了组织工程软骨的生物化学功能和生物力学功能。
　　微载体细胞培养技术是一种微载体与生物反应器结合的技术，现已广泛应用于组织工程领域。在动态培养过程中，外部流体力学刺激能够明显增加细胞增殖，促进细胞DNA的合成，利用生物反应器和微载体进行细胞扩增，细胞浓度最高可达到1×１０8/ml［8,9］。这在常规培养条件下是很难达到的。这首先是由于微载体有较大的表面积(Cytodex 3 110 g提供约4600 cm２的表面积)［2,5］，相同容积的生物反应器和普通培养瓶相比，前者可比后者多培养数10倍甚至100倍的细胞，可以满足较大体积组织构建对种子细胞数量的需求；其次因为整个培养容器由电机驱动沿水平轴旋转，培养基以及细胞颗粒随容器一起旋转，细胞微载体颗粒在水平轴内建立均质的液体悬浮轨道，使细胞所受到的重力、浮力及剪切力达到平衡，这就构成了一种微重力培养环境，利于细胞聚集，并在微载体表面各个方向上均衡扩增生长；最后一点在这种动态环境中，细胞与营养物质易于均质分布，显着改善微环境中的营养物质及代谢产物的交换，保持培养环境的均一性和稳定性，有效促进了细胞的增殖。
　　组织构建的另一个难题是怎样保持其诱导表型，不发生去分化。生物反应器和微载体介导的动态三维培养，不但为细胞增殖提供了良好的环境，而且周期性的力学刺激作为一种必要的物理信号在细胞的分化过程中起到了重要的作用。在动态环境中细胞活性增强，加之诱导因子的作用，使得大量蛋白合成分泌，形成特异的细胞外基质，促进了细胞的分化和成熟。总之，这种动态培养微环境提供了细胞聚集、快速三维生长和分化的条件，为工程化组织构建提供了更为有效的手段［10］。本实验的结果也证实了这一点实验中ADSCs在微载体上能够迅速贴附、伸展并快速增殖。第7 d细胞已将微载体表面完全覆盖，并凸出微载体表面生长，微载体间相互连接，呈团状生长。微载体培养在1周的时间内细胞数量增长了近20倍，而静态培养则仅为6倍，组织化学及免疫组织化学均显示微载体培养的细胞有较好的表型及细胞外基质。本研究为以ADCSs作为种子细胞构建组织工程软骨提供了实验依据，为进行更加深入的研究奠定了基础。

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