头孢他啶诱导大肠埃希菌内毒素释放及常用中药注射剂抗内毒素作用的体外研究.docx

头孢他啶诱导大肠埃希菌内毒素释放及常用中药注射剂抗内毒素作用的体外研究
【摘要】 目的 探讨头孢他啶对不同浓度大肠埃希菌内毒素释放的影响及常用清热解毒中药注射剂体外抗内毒素活性。方法 采用二倍稀释法测定头孢他啶对大肠埃希菌的MIC，并确定清开灵、双黄连和喜炎平注射剂临床常用剂量对MIC的影响；50×MIC头孢他啶对处于对数生长期不同浓度大肠埃希菌内毒素产生的影响；清开灵、双黄连和喜炎平注射剂与头孢他啶联合应用时抗内毒素作用的研究。结果 头孢他啶对大肠埃希菌的MIC为μg/ml，清开灵、喜炎平注射剂对头孢他啶的MIC无影响，双黄连注射剂可显着提高头孢他啶MIC；头孢他啶于高菌液浓度时可诱导内毒素释放，在低菌液浓度时抑制内毒素释放；中药注射剂与头孢他啶联合应用时，加药顺序对内毒素的产生有一定影响，当清开灵、喜炎平注射剂在头孢他啶之后应用时，可显着降低内毒素含量，喜炎平的效果优于清开灵注射液。结论 头孢他啶对大肠埃希菌内毒素释放的影响与菌液浓度有关。清开灵、喜炎平注射剂具有抗内毒素作用，与头孢他啶联用时，用药顺序对内毒素的消除有一定影响。
【关键词】 中药注射剂； 头孢他啶； 内毒素； 大肠埃希菌
ABSTRACT Objective To study the factors that influence the endotoxin release induced by ceftazidime in different Escherichia coli concentrations, and to explore the antiendotoxin effects of 3 kinds of Chinese medicine injections, namely Qingkailing injection, Shuanghuanglian injection and Xiyanping injection in vitro. Methods Twofold dilution to determine the MIC of ceftazidime, and determine if the MIC could be altered by 3 kinds of injections when used in routine dosages; to study if ceftazidime (at 50×MIC) could affect the production of endotoxin while added to different concentrations of Escherichia coli which in logarithm phase; to determine the antiendotoxin activity of the three injections when used concomitantly with ceftazidime. ResultsThe MIC of ceftazidime was　μg/ml, Qingkailing injection and Xiyanping injection had no effect on it, but Shuanghuanglian injection could lead it to increased; at high Escherichia coli concentrations (×104～×105 CFU/ml), ceftazidime induced a great deal of endotoxin release, but at low concentrations (×10～×103 CFU/ml), ceftazidime inhibited endotoxin release; the using sequence of Chinese medicine injections and ceftazidime could affect endotoxin release. When Qingkailing injection and Xiyanping injection used after giving ceftazidime, they showed antiendotoxin effect, and Xiyanping injection was the better. Conclusion The endotoxin releasing activities of ceftazidime were not only related to the bacterial concentrations but also influenced by the sequence usage of Qinakailing or Xiyanpang injections.
KEY WORDS Chinese medicine injections; Ceftazidime; Endotoxin; Escherichia coli
内毒素是众多细胞因子诱导剂，可触发炎症级联反应，其成分为革兰阴性菌细胞壁外膜的脂多糖成分。有人认为［1］，革兰阴性细菌所致的脓毒血症至今死亡率居高不下，是由于抗菌药物在杀灭细菌的同时伴随着内毒素的释放，产生高内毒素血症所致。我们据此设计实验，探讨头孢他啶在临床用量下对细菌内毒素产生的影响。寻找有效、低毒的抗内毒素药物一直是多年来的研究热点，据文献报道［2，3］，具有清热解毒作用的中药及其注射剂有抗内毒素作用，本文模拟临床用药剂量、顺序及间隔时间，体外实验考察了我院常用清热解毒中药注射剂清开灵、双黄连和喜炎平分别与头孢他啶联合应用时对大肠埃希菌产生内毒素的影响，旨为临床内毒素血症的治疗提供参考。
1 材料与方法
　材料
(1)菌种 大肠埃希菌ATCC25922，由河北医科大学第一医院检验科提供。
(2)培养基 改良型RPMI 1640(海克隆生物化学制品有限公司，批号NSG0059)。
(3)试剂 头孢他啶(每支，石药集团中诺药业有限公司，批号07043001)；清开灵注射液(每支10ml，河北神威药业有限公司，批号07032622)；双黄连粉针剂(每支600mg，哈药集团中药二厂，批号0611235)；喜炎平注射液(每支50mg，江西青峰药业有限公司，批号0080313)；细菌内毒素工作标准品(每支140Eu，中国药品生物制品检定所，批号150601200758)；内毒素测定试剂盒(湛江安度斯生物公司，批号0609271)。
(4)仪器 B600A型低速离心机(白洋离心机厂)；BET32B细菌内毒素测定仪(天津大学无线电厂)。
　方法［4］
(1)菌液配制 细菌接种于无抗生素的RPMI 1640培养液中，于37℃水浴中培养16h，作为细菌母液。
(2)头孢他啶MIC的测定 采用2倍稀释法于96孔板中测定头孢他啶在空白液、清开灵(500倍稀释液)、双黄连(/ml)及喜炎平(/ml)中对大肠埃希菌的MIC。终菌量为5×106CFU/ml左右，37℃保温箱培养20h。
(3)头孢他啶对大肠埃希菌内毒素含量测定 细菌母液临用前配成约1×108CFU/ml，再分别以RPMI1640培养液稀释成所需浓度备用。取5ml离心管若干，各加入2ml RPMI 1640培养液，37℃水浴预热10min，加入备用菌液50μl，使菌浓度分别为×105、×104、×103、×102及×10CFU/ml，水浴培养，使细菌处于对数生长期。每个浓度的菌液组各设2组(对照组和头孢他啶组)，各加入RPMI 1640培养液或头孢他啶液100μl，使头孢他啶终浓度为50×MIC(μg/ml)。继续水浴培养，离心取上清液20℃保存备用。按试剂盒说明方法测定RPMI 1640培养液内毒素基底值及各组内毒素含量。
　　(4)中药注射剂对大肠埃希菌内毒素含量测定 菌液制备如上述。取5ml离心管若干，加入2ml RPMI 1640培养液，37℃水浴预热10min，加入备用菌液50μl，使终菌浓度为×102CFU/ml，水浴培养，中药注射剂与终浓度为50×MIC的头孢他啶液各100μl先后加入(头孢他啶液在中药注射剂加入之前或之后加入)，中药注射剂的终浓度为：清开灵500倍稀释液，双黄连/ml及喜炎平/ml。继续水浴培养，离心取上清液，-20℃保存备用。内毒素测定方法同上。
(5)统计学分析 数据以±s表示组间采用t检验进行显着性分析。
2 结果
　中药注射剂对头孢他啶MIC的影响
头孢他啶的MIC为μg/ml，清开灵和喜炎平注射剂对其MIC值无影响，但双黄连注射剂可使头孢他啶的MIC增至32μg/ml以上。
　头孢他啶对大肠埃希菌内毒素释放的影响
RPMI 1640培养液内毒素基底值为零，培养液对内毒素测定没有影响。
在菌浓度较高时，50×MIC头孢他啶对大肠埃希菌内毒素的生成有诱导作用；菌浓度较低时可显着降低内毒素含量(表1)。
　中药注射剂对内毒素释放的影响
中药注射剂与头孢他啶的加入顺序对内毒素含量有影响，当中药注射剂晚于头孢他啶1h加入时，清开灵和喜炎平均可显着降低内毒素含量，后者效果好于前者，但双黄连未显示出降低内毒素的作用。当中药注射剂早于头孢他啶1h加入时，3种中药注射剂均未显示其抗内毒素作用(表2)。
3 讨论
抗生素对细菌内毒素产生的影响与多种因素有关［5］，如青霉素结合蛋白(PBPs)的种类、抗生素的浓度等。头孢他啶、头孢噻肟等抗生素在低浓度时与PBP3结合，使细菌成细丝状，有较大表面积，可产生 表1 头孢他啶对不同浓度大肠埃希菌菌液内毒素释放的影响表2 中药注射剂与头孢他啶联合应用的抗内毒素作用(较多内毒素；在高浓度时与PBP1结合，快速杀死细菌，使之溶解，产生较少量内毒素［6］。本实验发现，内毒素产生还与细菌浓度相关，头孢他啶在临床应用剂量(50×MIC)时，可在高菌液浓度(×104～×105CFU/ml)诱导产生大量内毒素，而在低菌液浓度(×10～×103CFU/ml)使内毒素含量大幅度降低。临床数据显示［7］，败血症成年患者血液中的菌浓度相对较低(10CFU/ml)，而幼儿患者特别是新生儿血液中的菌液浓度相对较高，最高在1000CFU/ml左右。从本实验数据可以看出，菌液浓度在小于×103CFU/ml时，头孢他啶在杀菌的同时是降低内毒素含量的，所以，认为革兰阴性菌败血症死亡率居高不下是由于应用抗生素后诱导产生大量内毒素的看法值得商榷，但应知道少量内毒素的持续存在可能对患者的危害更大［8］。
由于内毒素广泛的组织损伤作用，使得如何对抗内毒素以减少其有害反应成为广大医药工作者的关注热点，各国药典对注射剂中内毒素的含量都有严格限制，以阻止内毒素的摄入，但由于内毒素结构的复杂性及其作用的多样性，使抗内毒素药物的研究显得颇为困难，目前有确切抗内毒素作用的化学药品和生物制品除多黏菌素B外，皆处于研制或临床研究阶段。在我国，中药抗内毒素的研究比较广泛，其中具有清热解毒作用的中药显示了很好的抗内毒素作用，本实验对清热解毒中药注射剂清开灵、双黄连和喜炎平与头孢他啶联合用药对细菌内毒素的对抗作用进行研究，结果显示清开灵、喜炎平注射剂不影响头孢他啶的MIC，并可显着降低内毒素含量，但加药顺序对此作用有很大影响，当中药注射剂在头孢他啶之后应用时，可显着降低内毒素含量，喜炎平的效果更明显；但当在头孢他啶之前应用时，却对内毒素含量没有降低作用，可见抗生素、内毒素与中药注射剂之间的关系并不是单纯的是否影响MIC值的问题，其作用机制有待于进一步探讨。
双黄连注射剂为清热解毒中药制剂，具有抗菌和抗病毒作用，虽然在体外实验中其杀菌作用很弱，几乎无临床意义，但体内实验却显示了很强的抗菌效果，如双黄连注射剂可显着降低大肠埃希菌所致小鼠腹腔感染的死亡率［9］，与头孢他啶联用治疗慢性阻塞性肺疾病时有显着的协同作用［10］，体外实验也显示有很强的抗内毒素作用［8］，但本实验发现，双黄连注射剂与头孢他啶联合应用后，没有显示出抗内毒素作用，并可使头孢他啶的抗菌作用大大减弱，双黄连注射剂与头孢他啶可能存在配伍禁忌，以致相互影响而使药效减弱。目前为止尚未见国内有关报道，这一猜测还需今后的实验来证实。
综上所述，在应用头孢他啶之后加用喜炎平或清开灵注射剂，既可清除细菌，又能有效降低内毒素的含量，对败血症症状的控制可能具有临床意义。
【参考文献】
［1］ 王雪欣，钱元恕. 抗生素诱导内毒素释放的研究进展［J］. 国外医药抗生素分册，2002，23(4)：170～173.
［2］ 张霞，崔乃杰，王家泰. 清热解毒中药拮抗内毒素研究［J］. 天津中医，1999，16(1)：43～45.
［3］ 刘志峰，李桂生，傅风华，等. 8种中药注射液体外抗内毒素作用的观察［J］. 中草药，2002，33(1)：58～59.
［4］ 梁爱华，大野尚仁，宿前利郎. 头孢他啶诱导的细菌溶解和内毒素释放［J］. 中国抗生素杂志，1999，24(3)：195～198.
［5］ 司文秀，杨继章，杨树民. 抗菌药物诱导内毒素的产生及抗内毒素药物的研究进展［J］. 中国抗生素杂志，2007，32(8)：454～458.
［6］ Buijs J, Dofferhoff A S, Mouton J W, et al. Concentrationdependency of betalactaminduced filament formation in Gramnegative bacteria ［J］. Clin Microbiol Infect,2008,14(4):344～349.
［7］ Yagupsky P, Nolte F S. Quantitative aspects of septicemia ［J］. Clin Microbiol Rev,1990,3(3):269～279.
［8］ 李为，宋诗铎，官兰，等. 内毒素和抗生素杀菌滤液刺激全血细胞产生肿瘤坏死因子的作用［J］. 中华医院感染学杂志，1999，9(1)：16～18.
［9］ 季宇彬，谷春山，郎伟军，等. 双黄连粉针体内抗菌作用的实验研究［J］. 黑龙江商学院学报，1992，8(1)：1～5.
［10］ 于龙刚，于梅菊. 头孢他啶联合双黄连治疗COPD合并下呼吸道感染的临床观察［J］. 中国误诊学杂志，2007，7(27)：6511～5321.