甲壳类水产品中并殖吸虫囊蚴检测和鉴定技术规范_编制说明.doc

《甲壳动物并殖吸虫囊蚴检测和鉴定技术规范》编制说明
一．工作情况和任务来源：
根据国家认证认可监督管理委员会《关于下达2011年出入境检验检疫行业标准制（修）订计划项目的通知》（国认科函〔2011〕54 号）附件2中下达的编写任务通知，由上海出入境检验检疫局主持出入境检验检疫行业标准《甲壳类水产品中并殖吸虫囊蚴检测和鉴定技术规范》的起草工作（计划编号2011B229k）。
该标准经本工作小组成员讨论、修改后，形成第一稿（征求意见稿）。现将该征求意见稿发至有关口岸检验检疫局及相关科研单位和大专院校征求意见，以便根据回函中提出的建议和意见进行修改。
二．编制本标准的目的和意义
并殖吸虫病(Paragonimiasis)是由并殖吸虫(Paragonimus)引起的人兽共患寄生虫病，大约有80 多种甲壳类动物被作为并殖吸虫的第二中间宿主，其中主要为淡水蟹和喇蛄。人若吃了生的或未煮熟的含有囊蚴的石蟹、蜊蛄，囊蚴进入小肠，幼虫脱囊而出，穿过肠壁到腹腔，再穿过横膈进入肺内发育为成虫。成虫在宿主体内可活5～6年，长者达20年。不论成虫或幼虫都有移行的特点，在移行途中可寄生于其它脏器，但在肺以外的其它脏器，虫体大多数不能发育为成虫。并殖吸虫病在我国分布广泛，分布于我国的21个省(区、市)中的442个县(市)，有418个县发现并殖吸虫第二中间宿主的囊蚴阳性。本病有两种主要临床类型：卫氏型并殖吸虫病，由卫氏并殖吸虫等引起，以咳嗽、胸痛、咳果酱样痰等呼吸系统症状为特征，痰中常可找到虫卵；四川型并殖吸虫病（或斯氏并殖吸虫病），以皮下游走性包块、胸腔积液、心包积液、蛛网膜下腔出血及末梢血液酸性粒细胞明显增多为特征；根据痰检、活检或临床综合诊断已确诊的病例为70 853例。
在GB18406.4-2001《农产品安全质量无公害水产品安全要求》规定水产品中不得检出致病性寄生虫。目前为止，还没有检测并殖吸虫幼虫的标准，因此，迫切需要制定甲壳动物等水产品中并殖吸虫幼虫的检疫鉴定规程，以规范进出境水产品及国内上市水产品并殖吸虫的检疫，保障食品安全。
三．参考、采用标准情况
国内外无并殖吸虫的相关标准。
四 标准的编制过程
该标准是在国家质检总局课题“进境水产品重要人鱼共患寄生虫风险分析及检疫鉴定方法研究” （2010IK013）研究的基础上编写的。标准中，并殖吸虫囊蚴的鉴定分为形态学鉴定和分子生物学鉴定。并殖吸虫囊蚴的形态特征为：呈球形或近球形，直径约300 µm～400 µm，乳白色，具两层囊壁，但因虫种不同，可有三层囊壁或仅一层囊壁，后尾蚴挤缩于囊内。
并殖吸虫囊蚴形态比较难鉴定，并且种类较多，不同区域分布的虫种有可能不同。吸虫囊蚴都有囊壁包裹，形态未完全发育，在显微镜下有些科属的吸虫囊蚴大小形态相似，容易造成混淆，很难区分。考虑到虫种的溯源，用分子生物学方法鉴定种属是相对可靠且方便的方法。
本标准采用了传统捣碎法分离蟹肉中的囊蚴，分离到的囊蚴先通过形态初步观察，然后对虫体进行DNA提取，再用并殖吸虫的通用引物对ITS2基因进行特异性扩增，最后通过测序进行虫种的判定。这样确保了检疫的检出率与结果的准确性。卫氏并殖吸虫分布较广且比较典型，可以用特异引物进行检测，不需要测序以节省时间。标准所用引物为各国学者普遍采用的引物，并殖吸虫通用引物由Blair（1995、1997）等设计，卫氏并殖吸虫特异引物由Sugiyama（2002）等设计。课题组对引物进行了验证，并且优化了反应条件，用于临床上虫种的鉴定取得了理想的结果。

图1 卫氏并殖吸虫特异引物特异性实验
M：DL2000 DNA Maker;1 卫氏并殖吸虫；2 斯氏并殖吸虫；3 华支睾吸虫；4 东方次睾吸虫；5 棘口吸虫；6 背孔吸虫；7 空白对照。

在标准研究中也建立了FTA囊蚴检测法,即将蟹肉研磨后直接滴加于FTA卡上提取DNA，若蟹肉中混有囊蚴即能检测出来。但考虑到在实际检测操作过程中有可能所取蟹肉中取不到囊蚴，而且FTA卡敏感度低，操作不稳定，有可能会出现假阴性结果。为了确保准确性，本标准选择采用传统方法检测。
五．标准的使用情况
标准建立后，应用于上海口岸进境水产品的检验及国内水产品的监测。检测结果如下：
1、国内甲壳类动物中并殖吸虫检疫情况：2009年开始至2011年，在浙江省永嘉县采集溪蟹共500只，每只重量在30g左右，结果检出并殖吸虫的阳性率达到5.4%（27/500），其中最高感染囊蚴数为2412个，最低为9个。2011年1～4月对上海市场的水产品进行检测，包括醉泥螺（7件）、醉蟹（5件）、活溪蟹（10件）、虾（10件），均未检出寄生虫。
2、国外进口甲壳类动物中并殖吸虫检疫情况：2010年1月1日至2011年10月15日，对上海口岸进口的虾共79批和蟹104批，进行并殖吸虫检疫，均未检出并殖吸虫，样品来自越南、泰国、美国、加拿大、孟加拉、新西兰、澳大利亚等地。所检的进口样品均为海水虾蟹，故并殖吸虫检出率为0，并非本标准检疫技术存在漏检的可能性。

六．本标准的起草单位：上海出入境检验检疫局、中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所、广西大学。
七．本标准的起草人：李树清 陈韶红 陈盈 黄维义 张永年 陈志飞 李雯雯 王巧全 张强 王艳 李健。