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CD123在急性早幼粒细胞白血病微小残留病检测中的应用

　　 作者：王亚哲，常艳，主鸿鹄，秦亚溱，李金兰，付家瑜， 李玲娣，陈珊珊，黄晓军，陆道培，刘艳荣
【摘要】 为了探讨CD123联合应用其它免疫标志检测急性早幼粒细胞白血病(APL)中微小残留病(MRD)的作用及意义，采用四色流式细胞术(FCM)分析了186例初诊APL患者的免疫表型特点及20例正常骨髓中与APL细胞表型相同的细胞所占比例，并应用以CD34/CD117/CD123/HLA-DR为主的4色抗体组合对172份标本进行MRD检测并与实时定量PCR结果相比较。172份标本包括19例连续随访APL患者的116份骨髓或外周血标本和47例距初诊3个月至2年不等的非连续随访患者的56份骨髓标本，其中形态学完全缓解(CR)后117份，CR前55份标本。对18份标本同时加做抗体组合CD9/CD117/CD34/CD33检测。结果表明：初诊APL患者除高表达CD9、CD33、CD117和低表达CD34、HLA-DR外，CD123的阳性表达率为100%(30/30)；正常骨髓中CD117+CD34-CD123+HLA-DR-细胞和CD117+CD34-CD9+CD33+细胞在有核细胞中的比例分别为%和%，与APL患者相比相差4个对数级；随访期内，19例患者全部获得形态学CR，中位时间为4周(3-6周)，13例FCM结果转阴的中位时间为周(5-11周)，11例PCR结果转阴的中位时间为8周(5-12周)；形态学CR后随访的117份标本中41份FCM检测MRD呈阳性，8份标本CD117+CD34-CD123+HLA-DR-细胞比例5%，中位值为%(%-%)，33份标本CD117+CD34-CD123+HLA-DR-细胞比例5%，中位值为%(%-%)；CD117+CD34-细胞中CD123+HLA-DR-细胞的中位相对比例分别为%(%-%)和%(%-%)； FCM与PCR同时检测MRD结果显示，FCM(+)标本中%(93/97)PCR为阳性，FCM的假阳性率为%(4/97)，PCR的假阴性率为%(7/93)。FCM MRD(-)标本中，92%(69/75)PCR阴性，8%(6/75)为PCR阳性。连续随访的116份标本和形态学CR后的117份标本显示，CD117+CD34-CD123+HLA-DR-细胞比例与实时定量PCR检测的mRNA水平基本一致，两者均有一定的相关性 (r=，和r=，)。结论：应用CD34/CD117/CD123/HLA-DR为主的2组4色抗体组合检测APL患者中的MRD简单可行，可与PCR检测相互补充。
【关键词】 急性早幼粒细胞白血病

　　Application of CD123 in Detection of Minimal Residual Disease in
Acute Promyelocytic Leukemia
　　WANG Ya-Zhe，CHANG Yan，ZHU Hong-Hu，QIN Ya-Zhen，LI Jin-Lan，FU Jia-Yu，LI Ling-Di，CHEN Shan-Shan，HUANG Xiao-Jun，LU Dao-Pei，LIU Yan-Rong　
　　Institute of Hematology，People Hospital，Peking University，Beijing 100044，China
　　Abstract The study was aimed to investigate the role and significance of CD123 with other immunological markers in detecting minimal residual disease (MRD) of APL patients. The immunophenotypes of 186 newly diagnosed APL patients and the percentages of cells identical with APL cell immunophenotypes in 20 normal bone marrow samples were analyzed using four-color flow cytometry. MRD in 172 specimens were monitored mainly using CD34/CD117/CD123/HLA-DR four-color antibody panels，meanwhile 18 specimens were analyzed with the second antibody combination: CD9/CD117/CD34/CD33，simultaneously and the results were compared with real-time PCR. One hundred and sixteen of 172 bone marrow (BM) or peripheral blood (PB) specimens were from follow-up 19 newly diagnosed APL patients and the rest 56 samples were from 47 patients treated 3 to 24 months later. Among them，117 samples and 55 samples were collected after achieving morphologic complete remission (mCR) and before achieving mCR respectively. The results of immunophenotyping demonstrated that except CD9，CD33 and CD117 were high-expressed and CD34 and HLA-DR were rarely expressed，the CD123 was expressed in 30/30 (100%) APL patients. The percentages of CD117+CD34-CD123+HLA-DR- and CD117+CD34-CD9+CD33+ cells in nucleated cells were %±% and %±% in 20 normal bone marrow samples. The median time of achieving morphology complete remission in 19 APL patients was 4 weeks (3-6 weeks). The median time of FCM and PCR results turned to be negative in 13 APL patients was　weeks (5-11) and the median time of PCR results turned to be negative in 11 APL patients was 8 weeks (5-12). 41/117(%) samples were MRD positive by FCM after achieving mCR. The ratio of CD117+CD34-CD123+HLA-DR- cells was 5% in 33 specimens，but 5% in another 8 specimens，their median percentages of CD117+CD34-CD123+HLA-DR- cells were % (range %-%) and %(range %-%) respectively. The median relative percentages of CD123+HLA-DR- cells in CD117+CD34- population were % (range %-%) and % (range %-%) respectively. In FCM MRD positive samples，% (93/97) were PCR positive，the false positive rate of FCM and the false negative rate of PCR were %(4/97) and %(7/93) respectively. In FCM negative samples，92% (69/75) were PCR negative and 8% (6/75) were PCR positive. The percentages of CD117+CD34-CD123+HLA-DR- cells in 116 consecutive specimens and 117 specimens of mCR were related to PML/RARα quantified by real-time PCR (r=， and r=， respectively). It is concluded that the detection of APL patients by means of two sets of antibody panels is simple and suitable，which is complementary to PCR in monitoring MRD of APL patients.
　　Key words CD123; acute promyelocytic leukemia; minimal residual disease; flow cytometry
随着维甲酸和化疗的联合应用，90的急性早幼粒细胞白血病(APL)患者获得完全缓解(CR)［1］，5年生存率明显提高，但仍有5%-15%的患者最终复发。导致复发的主要原因是微小残留病(MRD)的存在［2］，因此及早发现MRD并对其定量有助于评判预后、预防复发及选择个体化治疗方案。以往，由于流式细胞术(FCM)检测APL患者的灵敏度较低，难以确定MRD阳性患者。近年来，Jordan等［3］证实CD123是急性髓系白血病干细胞的一个独特标志，在正常造血干细胞上极少表达。目前，有关CD123在白血病免疫分型中作用的报道较少，而有关CD123在MRD检测中的作用尚未见有公开文献报道，本实验首先检测初治APL患者CD123的表达，并探讨CD123联合其它免疫标志在检测APL患者治疗后残留白血病细胞中的作用及意义，以便简单、快速、准确地运用FCM检测MRD，为临床提供治疗线索。
　　材料和方法
　　研究对象
　　对2001年7月至2005年5月在本院就诊的186例初治APL患者进行了免疫分型分析，对其中30例，中位年龄38岁，增加了CD123抗体检测，另男81例，女75例，中位年龄34(6-78)岁。对66例APL患者进行了FCM MRD检测，包括19例连续随访者，其中男34例，女32例，中位年龄37岁；对他们每隔1周收集外周血(PB)样品，每隔1月收集骨髓(BM)样品，共检测了116份标本，包括形态学完全缓解(CR)前55份，CR后61份，平均随访时间为周(8周-33周)。对47例CR后APL患者进行非连续随访，共收集56份骨髓标本，距初诊3个月至2年不等，并用2组抗体组合检测18份治疗后APL标本，其中15份形态学CR，3份未缓解。选择20名健康志愿者作为对照，其中男14例，女6例，中位年龄38(30-46)岁。
　　FCM免疫表型检测
　　免疫分型
　　取肝素抗凝骨髓血2 ml，应用我室常规四色免疫分型方法对156例APL患者进行免疫分型分析［4］。对30例APL患者增加了CD123抗体检测。分析时以幼稚细胞群中抗原表达细胞20%作为阳性。
　　MRD检测
　　应用CD34/CD117/CD123/HLA-DR 1组抗体组合检测66例APL患者治疗前后的172份标本，对其中18份标本增加另1组抗体组合检测即：
　　CD9/CD117/CD34/CD33检测。每管获取750 000个细胞，采用CD117+/SSC值大和CD117+CD34-双设门，分析内容包括： ①CD117+且SSC值大的细胞在有核细胞中所占比例;② CD117+且SSC值大的细胞中CD34-细胞在有核细胞中所占比例;③ CD117+CD34-且SSC值大的细胞中CD123、HLA-DR或CD9、CD33抗原表达的相对比例，并乘以CD117+CD34-细胞的比例得到在有核细胞中所占实际比例。
　　正常骨髓中CD117阳性细胞的免疫表型检测

　　利用四色抗体组合分析了20例健康志愿者。检测的抗原包括CD117、CD3、CD7、CD9、CD19、CD13、CD33、CD34、CD38、CD56、CD123和HLA-DR。每管获取250 000个细胞，分析方法同MRD检测。
　　APL特异性融合基因PML/RARα的实时定量PCR检测
　　采用实时定量PCR方法［5］检测66例APL患者172份标本中PML/RARαmRNA的表达。
　　统计学处理
　　采用SPSS分析FCM与PCR检测结果的相关性，t检验比较APL与正常人的抗原表达。正态分布资料采用平均值±标准差( x±SD)。
　　结果
　　APL患者免疫表型
　　186例APL患者免疫表型与以往结果一致，如多数患者表达CD117、CD33和CD9，而CD34和HLA-DR多为阴性(表1)。CD34和HLA-DR阴性的患者中CD34和HLA-DR的平均表达率为%和%。通过对CD123检测发现，30例患者全部为阳性。Table 1. Expression of some antigens in acute promyelocytic leukemia patients (略)
　　正常骨髓中CD117阳性细胞的免疫表型
　　CD117+、CD117+CD34-细胞在有核细胞中的比例及CD117+CD34-细胞中其他抗原在有核细胞中表达的实际比例见表2。此外，CD117+CD34-细胞中CD123+HLA-DR-和CD9+CD33+细胞平均相对比例分别为%和%。
　　APL患者骨髓与健康骨髓检测结果比较
　　19例初治APL患者经形态学检测的幼稚细胞平均数为%(%-97%)，FCM检测CD117+CD34-CD123+HLA-DR-细胞平均比例为%(%-%)；20例健康志愿者的平均比例为%(%-%)，两者相差3个对数级(log)()。APL患者CD117+CD34-细胞中CD123+HLA-DR-细胞的平均相对比例为%±%，而健康志愿者为%±%，两者有显着差异()。这一抗体组合为较理想的检测MRD的组合。另外，健康志愿者CD117+CD34-CD9+CD33+细胞的比例也较低(表2和图1)，选择第2种抗体组合。其它抗体组合正常值较高，均不理想。Table 2. Antigen expression of CD117+ cells in normal bone marrow (略）
　　FCM MRD检测
　　根据正常值范围和PCR检测的结果，确定患者获得形态学CR后微小残留病(MRD)阳性的标准为： ①CD117+CD34-CD123+HLA-DR-细胞实际比例≥%(平均值±2×标准差)(图2A)；②实际比例＜%，但CD117+CD34-细胞中CD123+HLA-DR-细胞的相对比例≥12%(平均值±3×标准差)(图2B)。
CD9/CD117/CD34/CD33组合检测MRD阳性的标准为： CD117+CD34-CD9+CD33+细胞实际比例≥%或CD117+CD34-细胞中CD9+CD33+细胞的相对比例≥28%。
　　19例随访患者获得形态CR的中位时间为4周(3-6周)，在CR前收集55份标本，经FCM检测CD117+CD34-细胞平均比例为%(%-%)，CD117+CD34-CD123+HLA-DR-细胞平均比例为%(%-%)。
19例连续随访的患者中13例FCM检测结果转阴，转阴时间距初诊的中位时间为周(5-11周)，其余6例治疗6-8周后出院并未再复查或未到复查期。FCM检测结果转阴前共36/61份(59%)标本MRD阳性，其中8份CD117+CD34-CD123+HLA-DR-细胞中位比例为%(%-%)，相对比例为%(%- %)；28份标本中位比例为%(%-%)，相对比例为%(%-%)，其中24例实际和相对比例均符合MRD阳性标准，4例实际比例不高但相对比例12%。非连续随访的47例患者FCM检测结果转阴时间距初诊的中位时间为月(3-24月)，共3例患者5份标本MRD阳性，阳性标本CD117+CD34-CD123+HLA-DR-细胞的中位比例%(%-%)，中位相对比例为%(%-%)，其中3例实际比例%，但相对比例12%。5例患者中1例连续3份标本经FCM、PCR检测结果均为阳性，2周后均转阴；2例患者2份标本FCM检测结果为阳性，但PCR检测结果为阴性，其中1例4周后复查FCM和PCR检测结果均为阴性，另外1例未继续检测。表3显示41份MRD阳性标本的时间分布。76份MRD阴性，CD117+CD34-CD123+HLA-DR-细胞的中位比例为%(%-%)，中位相对比例为%(%-%)。 Table 3. Incidence of MRD+ samples in patients with APL after morphology remission
对14例患者CR后同时检测BM和PB标本，结果BM中CD117+CD34-细胞的比例是PB中比例的倍，CD117+CD34-CD123+HLA-DR-细胞的实际比例是PB中实际比例的倍，但BM中CD123+HLA-DR-细胞的相对比例较PB低，是PB中相对比例的。
两组抗体组合检测发现，18份标本中3份在形态学上未CR，两组合中细胞实际比例均大于10%；形态学CR的15份标本中9份距初诊3-6周不等检测MRD同为阳性，CD117+CD34-CD123+HLA-DR-细胞中位比例为%(%-%)，CD117+CD34-CD9+CD33+细胞中位比例为%(%-%)；5份标本距初诊6周后检测MRD同为阴性，两组合细胞中位比例分别为%(%-%)和%(%-%)；1份距初诊8周的标本在CD123组合中实际和相对比例均符合MRD阳性标准，但不像典型APL细胞，CD9组合中MRD阴性，可能是非特异性细胞黏附造成的假阳性。总之，两组合变化基本一致，但CD9组合较CD123组合细胞比例高，无显着性差异。
　　FCM与PCR检测结果的比较
　　19例连续随访患者经PCR检测11例转阴，中位转阴时间为8周(5-12周)。8例FCM与PCR检测结果同时转阴，3例于FCM检测结果转阴1-2周后PCR检测结果转阴。
19例随访患者形态学上CR和未CR的116份标本，其FCM与PCR检测结果的变化趋势基本一致，两者有一定的相关性(r=，，图3)。10例患者在距初诊24周和距形态学CR 1-2周时PML/RARα平均升高了%(%-%)，与前1周相比，平均升高倍数为()，其中5例FCM结果也升高，但上升倍数为()。
172份标本中117份形态学CR和55份形态学未CR。对172份标本同时进行了FCM与PCR检测。结果显示，两种检测均为阳性的标本93份，其中7份PCR检测原为阴性，但6份标本内参弱，连续监测的前后1周PCR检测均为阳性，且5份PML/RARα mRNA水平均较高；另1份为PCR检测阴性的BM标本，同一天PB阳性，故认为此7例标本PCR检测为假阴性(%)，而以PCR阳性进行统计。由此得出，FCM(+)标本中%(93/97)PCR为阳性，4份标本PCR检测为阴性，假阳性率为%(4/97)。FCM(-)中，92%(69/75)PCR为阴性，8%(6/75)PCR为阳性。这些结果说明当FCM为阴性时，多数患者PCR也达到阴性水平，只有8%患者FCM阴性而PCR阳性，结果不同可能是因为两种方法的灵敏度不同所致，PCR的灵敏度高于FCM检测水平。Table 4. Comparison between results by FCM and PCR (略)
CR后FCM与PCR检测结果的比较表明，117份CR后标本FCM检测结果与PCR结果有一定的相关性(r=，)，部分患者两项检测结果不一致。通过FCM检测的发现，PCR的假阴性为%(7/93)。
　　讨论
　　急性早幼粒细胞白血病约占AML的10%-15%，化疗、维甲酸、砷剂和分子靶向药物的联合应用使APL患者的CR率达到较高水平，但并非所有患者能够长期生存，仍有部分复发，甚至威胁生命。MRD的存在是导致复发的主要原因。目前定量PCR检测PML/RARα是MRD检测的金标准，其最大优势是灵敏度高达10-4-10-5，但操作较烦琐、费时且标本量少、内参不好时易出现假阴性。目前定量PCR检测的是基因拷贝数，不同细胞该基因拷贝数不同，难以换算成细胞比例，定量较抽象；而PML/RARα阳性的初治患者基因表达量变异较大，治疗后难以确定复发阈值，由于其灵敏度较高，阳性时不一定预示复发。FCM检测MRD的主要优点是操作简单、快速，可反映白血病细胞比例，定量较直接，在检测ALL MRD时易确定复发阈值；缺点是灵敏度比PCR低，在ALL检测中可达10-4，而在AML中一般文献报道为10-3。由于缺乏理想的抗体组合，FCM检测APL患者MRD的灵敏度甚至低于10-3，限制了其应用。
文献报道［6］与本室［4］结果已证明，APL患者有较特异的免疫表型：SSC较大，CD34、HLA-DR多为阴性，高表达CD117、CD9、CD13、CD33、CD38。我们对正常骨髓的检测结果显示，具有APL免疫表型特点的细胞如： CD117+CD34-CD13+HLA-DR-、CD117+CD34-CD33+HLA-DR-、 CD117+CD34-CD38+HLA-DR-细胞比例在正常骨髓中均较高(表2)，影响灵敏度，不适于MRD的监测。通过对30例初诊APL患者检测发现，CD123表达均为阳性，且平均阳性细胞数均高，APL患者骨髓幼稚细胞基本为CD117+CD34-CD123+HLA-DR-CD9+CD33+，正常人群中CD117+CD34-CD123+HLA-DR-和CD117+CD34-CD9+CD33+细胞比例较低，两者存在显着性差异()，这就为利用CD117+CD34-CD123+HLA-DR-和CD117+CD34-CD9+CD33+组合检测APL中的微小残留病奠定了基础。
确定MRD的阳性标准是FCM检测MRD的前提，不同实验室的报道不相同［7］。本实验根据正常骨髓CD117+CD34-CD123+HLA-DR-细胞的实际比例和PCR检测结果首先确定MRD阳性标准：实际比例≥平均值+2×标准差(%)。7份标本实际比例%，但CD123+HLA-DR-细胞的相对比例≥12%，参考PCR结果，我们确定实际比例%时若相对比例≥平均值+3×标准差(12%)，也应认为MRD阳性。7份标本实际比例太低的原因可能是骨髓受抑制，导致CD117阳性细胞数量低。
本研究证明，患者获得CR后3周左右FCM检测结果即可转阴，且多数患者在FCM结果变为阴性时PCR检测结果同时转阴，这说明多数患者在短期内获得基因缓解。个别患者FCM和PCR检测转阴时间较长，其预后意义尚需观察。
根据两项MRD标准，FCM检测MRD阳性而PCR阴性的标本4份，假阳性率为%(4/97)。经FCM检测发现，PCR检测的假阴性率为%。个别患者在第2周时PCR结果由初治的%降为%，第3周又升为81%，而FCM检测第2周时白血病细胞无明显减少，考虑第2周时PCR结果有问题。以上说明两项检测可相互补充各自缺陷。FCM阴性的75份标本中共有6份(8%)PCR阳性，PML/RARα%，这并非FCM的假阴性结果而是由于PCR检测的灵敏度高于FCM，这说明此6份标本的MRD水平低于FCM检测水平，而高于PCR检测灵敏度。
同时进行FCM与PCR检测发现，两者具有一定相关性。正常骨髓中有%±%细胞表型为CD117+CD34-CD123+HLA-DR-，当残存的具有此表型特点的APL细胞在此范围或低于此值时，FCM则不能精确反应MRD的实际水平。与PCR进行比较时发现，当PML/RARα1%时，CD117+CD34-CD123+HLA-DR-细胞比例不随PML/RARα减少而减少。本研究中有18份标本PML/RARα1%，其中13份FCM阳性，5份FCM阴性。此结果说明PML/RARα mRNA水平较低时FCM检测可能出现阴性结果。10例随访患者在获得CR前后出现PML/RARα mRNA水平明显升高，7例甚至超过初诊时水平，其中5例伴FCM检测结果上升，但上升倍数较PCR低，其原因不明，经分析发现mRNA水平的升高与外周血WBC数，骨髓和外周血幼稚细胞和粒细胞比例无明显相关。此现象是否为化疗导致PML/RARα mRNA水平增加，尚需实验证明。14例形态学CR患者的BM中CD117+CD34-细胞、CD123+HLA-DR-细胞的实际比例及PML/RARαmRNA水平大于同一天的PB标本，但相对比例低于PB，此现象的可能原因是骨髓处于恢复期，正常增殖的CD117+CD34-细胞混于其中使CD123+HLA-DR-细胞比例相对下降，这进一步说明考虑把相对比例作为阳性标准的必要性。
CD9/CD117/CD34/CD33组合虽不如CD34/CD117/CD123/HLA-DR组合敏感度高，但同时应用可增加结果的可靠性。
综上所述，CD123的应用为FCM快速、准确、高效地检测APL中的残留白血病细胞提供了可能，两组合联用可以与PCR相互补充、弥补不足，进一步提高诊断的准确性。考察患者MRD水平变化的主要目的是指导治疗，由于随访时间短，MRD阳性及其早期变化对预测患者复发、对总生存率、无病生存率的影响还需进一步追踪研究。
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