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同种异体腱移植重建膝关节交叉韧带的研究
【摘要】 目的 从实验角度观察程序冷冻液氮保存和－80℃深低温保存方法处理同种异体髌腱后重建膝关节交叉韧带的愈合过程并比较其差异。方法 将兔的1/2骨髌腱骨复合体经-80℃深低温保存和程序冷冻液氮保存2周后观察冻存变化差异并行同种异体移植重建前交叉韧带，分别于术后3周和8周观察细胞毒反应、细胞活性、最大载荷和形态学变化等指标进行比较并与自体移植组对照。结果 a)经程序冷冻液氮保存方法处理后，髌腱的最大载荷无明显下降，细胞活性得到了较好的保存，组织学观察冷冻损伤较－80℃深低温保存方法轻微；b)程序冷冻液氮保存处理的移植物在术后未表现明显的排斥反应，且免疫反应随时间的推移而下降；c)移植后3周，各组移植物的最大载荷无显着差异(P＞)，移植后8周，程序冷冻液氮保存组移植物的最大载荷(±)N优于－80℃深低温保存组(±)，而和自体移植组相近(±)N；d)从组织学观察看，－80℃深低温保存组和程序冷冻液氮保存组移植后的愈合过程均和自体移植组相似，而程序冷冻液氮保存组的愈合过程和组织学行为更接近于自体移植组。结论 经深低温保存的兔异体髌腱重建膝关节交叉韧带后愈合过程和自体韧带移植重建过程相似。程序冷冻液氮保存法优于传统的－80℃深低温保存法。
【关键词】 同种异体腱；交叉韧带；重建
Abstract：Objective To study the difference of healing process of reconstructing the knee cruciate ligaments with allograft tendons which were treated by program freezing and －80℃ deep Reconstruct the ACL of the knee with the BPTB of rabbits which had been preserved for 2 weeks with －80℃ deepfrozen or liquid nitrogen deepfrozen after program freezing，and the cells poison response，cells activity，the maximum load and morphologic changes of the grafts were observed to compare the two allografting groups each other and compare them with the autografting　treated by：program freezing，the maximum load of the allografts has no evident decrease and the cell activity of allografts was preserved well，the frozen hurt after program freezing was more slight than －80℃ deepfrozen， evident reject reaction can be seen during the healing process after deep frozen and the reject reaction declined as the time pass　weeks afer the allografting，there was no significant difference between the two al lografting groups in maximum load(P＞)，Eight weeks later，the maximum load of the　group that was preserved by liquid nitrogen after program freezing(±)N was better than the group that was preserved by －80℃ deepfrozen(±) and similar with the autografting group(±). healing process and histological behavior of the two deepfrozen groups are similar with the autografting group，and the program freezing group is　healing process of the two deepfrozen allografting groups is similar with the autografting　program freezing method is better than the traditional －80℃ deepfrozen method in this experiment.
Key words：allograft tendon；cruciate ligament；reconstruction
膝关节交叉韧带损伤公认的手术方法是韧带重建，但自体材料移植存在着取腱并发症和组织来源有限等问题，而人工韧带技术发展不成熟，生物工程韧带也只是处于研究阶段，在这种情况下，同种异体腱移植成为重建膝关节交叉韧带的另一种选择。目前深低温冷冻是保存同种异体腱最可行的方法［1］，最常用的是－80℃深低温冰箱保存，但其保存时间有限，且不能理想地保存细胞活性，而普通液氮保存方法又不能做到严格的控制性降温。因此，在实验中我们对移植物的冻存方法作了一定的改进，提出了程序冷冻液氮保存的方法处理异体肌腱，做到了液氮保存前严格控制性降温，最大限度地减少了超深低温冷冻对肌腱的损伤。
1 材料与方法
　实验动物与分组 新西兰大白兔82只，体重2 000±100 g，随机分为A、B、C三组。A组12只大白兔取双侧膝关节1/2骨髌腱骨复合体共48条，将所取BPTB再随机平分为三组，即新鲜未冷冻组(A1组)、－80℃深低温保存2周组(A2组)和程序冷冻液氮保存2周组(A3组)，以比较冷冻对兔髌腱的影响；B组10只供异体腱；C组60只大白兔再随机平分为三组，即自体移植组(C1组)、－80℃深低温保存异体移植组(C2组)和程序冷冻液氮保存异体移植组(C3组)，以比较不同保存方法对移植物愈合过程的影响。
　髌腱复合体的取材与保存 A、B两组动物取双侧膝关节髌骨髌腱胫骨结节复合体平分，以1/2骨髌腱骨复合体做为测试样本或移植物。程序冷冻液氮保存方法：将冻存管放入程序冷冻仪(CBS2100，USA)中，按设定好的冷冻程序先以1℃/min的速度降至4℃，平衡 h，再以℃/min的速度降至－80℃，然后以1℃/min的速度降至-180℃，最后置于液氮储存罐中保存2周备用。
　手术方法 异体骨髌腱骨复合体移植前先于40℃生理盐水中融化15 min复温及庆大霉素盐水漂洗，然后植入替代异体移植组兔的右侧膝关节前交叉韧带，自体腱移植随机取左侧膝关节的内侧半或外侧半骨髌腱骨复合体植入右侧膝关节。
　各项观察指标的测定方法
　淋巴细胞毒反应 以供腱组兔脾脏提取淋巴细胞，调节浓度制成5×106/mL的淋巴细胞悬液备用［2］。将受体组兔取动脉血2 mL，凝固、离心提取上层血清。将受体血清100uL加入微试管内，再加入与之对应的供体兔淋巴细胞悬液100uL，轻轻摇匀，放入恒温培养箱内孵育37℃/45 min，待冷却后再加入补体(兔血清制备)500uL，室温(20℃)下培养1 h，然后加入台酚兰试剂2滴染色5 min，显微镜下淋巴细胞计数。淋巴细胞死亡率＝死亡淋巴细胞数/淋巴细胞总数×100％。
　移植物强度测试 将BPTB复合体或重建后的移植物骨块穿钢丝并以骨水泥包埋制成拉伸试件，然后以自动材料试验机(Model1011 Instron Tester，USA)作匀速单轴加载试验(测试过程中保持试件的湿润)，先给予的微小预负荷，反复拉伸、松弛10次，然后以50 mm/min速度拉伸试件至完全断裂，取韧带自实质部断裂的试件记录最大载荷测定值。
　细胞活性测定［3］ 将每个样本切成3段，用含％胶原酶RPMI1640液分别消化切碎的每段肌腱，分离获取细胞成分，调节浓度为1×109/L，将肌腱细胞悬液用4％锥虫蓝染色，低倍镜计细胞总数及被染色死亡细胞数，计算细胞活力，每根肌腱取3段的平均值为腱细胞活力测定值。细胞活力(％)＝(细胞总数死亡细胞数)/细胞总数×100％。
　形态学观察 每组随机选取2个标本观察大体形态并取材行光镜及透射电镜观察。
　统计方法 先用方差分析(F检验)比较各组样本均数间的总体变异，如果差别有显着意义，则用SNK检验对各组的样本均数进行两两比较并分析其差异。如需比较术后不同时段的指标差异则用独立样本t检验。以软件行统计学分析，检验水准α＝。
2 结果与分析
　冷冻保存后移植物强度和细胞活性测定 各组的最大载荷无显着性差异(P＞)，说明经两种深低温冷冻方法处理后，髌腱的最大载荷无明显降低。三组的细胞活性两两比较均有显着性差异(P＜)，结合实际数据说明经两种冻存方法处理后，细胞活性均有一定程度的下降，而程序冷冻液氮保存方法能更好的保存细胞活性(见表1)。表1 不同保存方法处理后的最大载荷和细胞活性测试结果
　髌腱移植物术后淋巴细胞毒反应和移植物强度测定 三组的淋巴细胞死亡率在术后3周和术后8周均无显着性差异(P＞)，而且两个异体移植组在术后8周较术后3周均有显着差异(t检验，P＜)。可认为经两种冷冻方法处理后抗原性均明显降低，而且随移植时间的推移免疫原性会逐渐下降(见表2)。三组在术后3周的最大载荷无显着性差异(P＞)，而在术后8周，SNK检验表明，程序冷冻液氮保存组和自体组无显着差异(P＞)，而和－80℃保存组比较有显着差异(P＜)，说明在术后8周，程序冷冻液氮保存组移植物的最大载荷优于－80℃深低温保存组而接 表2 移植术后各组淋巴细胞死亡率结果表3 移植术后各组的最大载荷测试结果
　　　形态学观察
　大体形态 新鲜肌腱表面光滑、色泽白亮、质韧、弹性好，－80℃深低温保存2周和程序冷冻液氮保存2周后的肌腱与新鲜肌腱无明显差异；三组在肌腱移植后3周和8周大体形态无明显差异，3周时韧带表面较粗糙、色白、略黄、质较软、光泽度及弹性较差，8周时韧带表面较光滑、色白、光泽度及弹性恢复，但比新鲜肌腱稍差。
　光镜观察(图2～10)及透射电镜观察结果(见表4) 图2 正常兔髌腱(HE×40) 图3 －80℃深低温保存2周(HE×40) 图4 程序冷冻液氮保存2周(HE×40)
3 讨 论
　同种异体腱的保存方法 目前深低温冷冻保存是保存同种异体腱最可行的方法［4］。常用的－80℃深低温冰箱保存不能理想地保存细胞活性，而且保存时间有限。普通的液氮保存方法不能做到严格的控制性降温而致腱组织损伤。实验中，我们提出了程序冷冻液氮保存的方法处理异体腱，做到了液氮保存时严格控制降温，最大限度地减少了超深低温冷冻对肌腱的损伤，而且可以充分发挥液氮保存的时限优势。
　冻存对异体腱抗原性的影响 国内外研究表明，深低温冷冻可以降低异体腱的抗原性，我们在实验中也发现冻存处理的异体腱在移植后不表现明显的抗原性。肌腱主要由胶原纤维组成，细胞成分较少。肌腱胶原纤维的抗原性仅在种 图5 自体移植3周(HE×40) 图6 －80℃保存异体移植3周(HE×40) 图7 液氮保存异体移植3周(HE×40) 表4 光镜观察及透射电镜观察结果比较纤维排列较规则，纤维粗细不均。细胞数量仍较多，排列基本规整，核呈梭形，但相对较大。纤维排列较规则，横纹不清晰。细胞体积较大，粗面内质网减少。程序冷冻液氮保存异体移植8周纤维排列较规则，纤维间隙较小。细胞数量仍较多，但排列基本规整，核大多呈梭形。纤维排列较规则，横纹较清晰。细胞体积较大，粗面内质网减少。
间有特异性，肌腱组织的抗原结构主要存在于腱细胞表面，通过冷冻处理，可以改变细胞膜表面的抗原结构而降低抗原性［5］。本实验应用透射电镜观察也发现了冷冻保存腱细胞细胞膜结构不同程度的破坏。
　冻存对移植物力学性能的影响 国内外的研究倾向于深低温冷冻不影响肌腱的力学性能［6～9］。本实验也进一步证明了该观点。在移植术后，其力学性能要经过一个动态变化的过程。在移植早期，由于胶原的分解代谢较强，而新合成胶原排列欠规则，从而导致力学强度的降低，后期随着合成代谢的增强以及胶原重塑后纤维结构排列的规则，力学性能也会逐步增强。
　异体腱移植后的修复方式 同种异体腱移植后的修复及愈合过程与自体腱移植相似，移植物移植后需要经历3个阶段：a)坏死阶段；b)再血管化和细胞增殖阶段；c)胶原重塑阶段［10］。但我们在实验中发现，程序冷冻液氮保存法处理的异体腱修复速度比－80℃深低温保存组要快而成熟，其组织学行为更接近于自体移植，原因可能是程序冷冻液氮保存方法保存了
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