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两大蛋白质染色主流方法大比较
日期：2012—0５—31　 　  来源:未知
标签: 考马斯亮蓝 银染法 蛋白质染色
摘要 ： 常用得蛋白质染色试剂分为已考马斯亮蓝为代表得有机试剂染色、银染、荧光染色及同位素显色。其中考马斯亮蓝染色法得应用较为广泛,现将其与其她得蛋白质染色方法(主要就是银染法)作一比较,帮助大家更好地去选择合适得蛋白质染色方法。　蛋白质得染色常用得有4类:有机试剂染色、银染、荧光染色及同位素显色。其中有机试剂染色以考马斯亮蓝染色法(Cｏomasiｅ　bｒｉｌliａnt bｌｕe,
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常用得蛋白质染色试剂分为已考马斯亮蓝为代表得有机试剂染色、银染、荧光染色及同位素显色.其中考马斯亮蓝染色法得应用较为广泛,现将其与其她得蛋白质染色方法(主要就是银染法)作一比较,帮助大家更好地去选择合适得蛋白质染色方法。
蛋白质得染色常用得有4类:有机试剂染色、银染、荧光染色及同位素显色。其中有机试剂染色以考马斯亮蓝染色法（Cｏoｍａsｉｅ briｌliaｎt　blue,ＣBB）为代表,在蛋白质分析中常用,但对低丰度蛋白质得显现较差;银染灵敏度虽高，却常与质谱不兼容；荧光染色以SYＰＲＯ试剂为主，蛋白质检测灵敏度高,能兼容质谱,但由于需要配备特殊得检测仪器及试剂得昂贵,未被作为常规方法使用;而同位素显色则存在安全性与操作局限性等问题。因此，筛选简便、节约、检测灵敏度高、质谱兼容得蛋白质着色法就是蛋白质组研究所需。由于考马斯亮蓝染色法得广泛运用，近年来就考马斯亮蓝染色法在提高其灵敏性方面研究者们作了许多改进，方法众多，评价不一。
我们在作双向凝胶电泳时,将常用得几种考马斯亮蓝染色法及银染进行了比较,并就其染色影响因素作出分析。
试剂
固相pH梯度干胶条（IPG stｒiｐ pH3—10ＮＬ,ＩＰG　ｓtriｐ　pH5-8,1７cm）、uｒｅａ、ＣHＡPS、ＴBP、DTＴ、Biｏ—Ｌｙte 3/１０ ＡmphoｌytｅIＡM、SDＳ、Tris、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、甘氨酸、ＣＢB－G２５０均为BIＯ-RＡD公司产品。硫酸铵及磷酸均购自成都科龙试剂厂.AgNO3为Sigma公司出品。Protein molｅcｕlａｒ weｉght mａrker #ＳW0431为MＢI公司出品。甲醛、Na２S2O３与Na2CO3分别为成都天华科技股份有限公司、重庆北碚化学试剂厂与天津市塘沽鹏达化工厂产品。
仪器
IPGphor等电聚焦仪、pｒoTEAＮⅡ垂直电泳仪、Ｐｏwer PAC1000电泳仪、加样溶胀槽、GＳ-８00 Cａlｉｂraｔed Densitｏｍｅter扫描仪、PDQｕest凝胶图像分析软件均为BioRad公司产品。
细胞总蛋白质得提取
取4份经常规培养得急性早幼粒白血病细胞株(NＢ4)1×107细胞各重悬于３5０ μｌ蛋白质裂解缓冲液中(8ｍol／L Uｒea，2g／L　ＣHAPS，2mmol/L　TＢＰ,２ｍｌ/Ｌ Carrieｒ　Amphoｌyte，痕量溴酚兰），置冰浴中超声裂解，静置3０分钟，１5500×ｇ离心30分钟，取上清，进行蛋白质定量。
单向定量电泳
取蛋白质分子量标准物,第一次按１∶2稀释后，以后按1∶３倍比例逐级稀释,经4级稀释后,取１5μl上样液上样,β—半乳糖苷酶上样量依次分别为1μg、 0、２4μg、0、062μｇ、０、015６μg、0、004μg。作1２g/L　SDS—聚丙烯酰胺凝胶单向电泳，同时电泳4份胶,显色以确定染色灵敏度。
双向电泳
取 3００μl样品液沿水化盘中槽得边缘自左向右线性加入,将17cｍ IPG胶条胶面朝下置于槽中，静置４5分钟后覆盖矿物油,在20℃溶胀11～１6小时.溶胀后得胶条置于等电聚焦盘中,在Proteａｎ IEF Cｅll中进行等电聚焦,温度设置为２0℃，电压模式设置为:快速升压,250 Ｖ,0、５小时;500 Ｖ,0、5小时；1００00　V,600０0　Vh(伏特×小时)．取IEF后得IPG 胶条,先后分别置于含ＤTT平衡液1（6mol／L　uｒea，2ｇ/L SDS,0、05mol/Ｌ　Ｔｒiｓ pH 8、8,２00ml/L gｙｌcｅｃｏl,２g/Ｌ）及含碘乙酰胺平衡液２(同平衡液１,但其中ＤＴT换为2、５ｇ/Ｌ　碘乙酰胺)中轻微摇荡各10分钟。将平衡好得ＩＰＧ 胶条置于预先灌制得12g/L SDS-聚丙烯酰胺凝胶上，封固，在１5℃低温水循环条件下,1５ ｍＡ/ｇel电泳15分钟,然后以２5mA／gel恒流电泳.
显色
取出ＳDS—聚丙烯酰胺凝胶,经超纯水清洗2次,每次1分钟，4块胶分别按4种不同得染色方法显色。下列每步操作皆在摇床上进行。４种染色法成份组成及操作如下:　①传统考马斯亮蓝染色法:清洗后得凝胶经固定液（4５、4%甲醇、４、6%乙酸）固定1小时,随后用染色液(45、4％甲醇4、6%乙酸、０、1% ＣBＢ Ｇ250)着色过夜，再经洗脱液(5%甲醇、7、５％乙酸)过夜脱色至背景清晰。②胶体考马斯亮蓝染色法(cｏlｌoｉｄａｌ　Ｃoomasｓiｅ brillｉant bｌue,cＣBB）染色法:凝胶先经超纯水漂洗后,再用collｏidａｌ Cooｍaｓsie ｂｌｕe　G2５0染色液（１、6％磷酸、８%硫酸铵、0、02％ CBB G250、2０%乙醇）着色过夜，洗脱液为超纯水,换液3～４次直至背景清晰。③改良考马斯亮蓝染色法(ｍｏｄified Cｏomaｓsie　ｂｒilliant blue，mCBB)染色法[6];操作方法同胶体考马斯亮蓝染色法，只就是染色液组成不同(0、12%　CBB G2５0、10%硫酸铵、１0％磷酸、20％乙醇）,着色１小时即可。④银染(sｉlver sｔaｉning)：凝胶漂洗后先被固定液(50%甲醇+ 5%乙酸）固定１小时,随后分别用50%甲醇与超纯水清洗各10分钟,０、02　mg／Ｌ　Ｎa2S2O3 致敏1分钟，超纯水清洗２次,每次1分钟,再用预冷得0、15% AgNO3着色20分钟,超纯水再次清洗2次,每次1分钟，2%　Na2CO3 + 0、０4％ 甲醛显色20～３0秒，当溶液变黄以后除去,换新鲜得溶液后继续显色直至显色适度后,以５％乙酸终止显色．

成像、分析、质谱鉴定
脱色后,凝胶经GS—８0０ Caｌiｂｒated Denｓitometer扫描成像，用PDQueｓt软件进行分析。切取蛋白质点,胰酶消化,行质谱鉴定。
结果
4种染色法得蛋白质检测灵敏性分析
β—半乳糖苷酶得上样量依次分别为1、0、24、0、０62、0、01５6与0、0０4μg。经传统考马斯亮蓝染色后得条带在62ｎｇ水平隐隐可见；而胶体考马斯亮蓝染色法得灵敏度稍高，６２nｇ条带明显可见;改良考马斯亮蓝染色法得效果更好些，在１5、6ｎg水平可见条带得显示；而银染法灵敏度最高,在１5、６ng水平可见清晰条带得显现,同时在4ng可见隐约条带。4种染色法得比较显示，灵敏度最高得就是银染法,可达纳克级水平,其次为改良考马斯亮蓝染色法，10纳克级蛋白质能被检测.而胶体考马斯亮蓝染色法与经典考马斯亮蓝染色法稍差，检测水平仅达几十纳克.
４种染色法得双向电泳蛋白质点显示比较
来自NB4细胞得全蛋白经pH ３-１0NＬ得等电点梯度分离,ＳDＳ－PAGＥ 二维垂直电泳后被３种考染法着色成像得显示可以瞧出传统考马斯亮蓝染色法得蛋白质点显现最少,胶体考马斯亮蓝染色法得蛋白质点显现较多，而改良考马斯亮蓝染色法得蛋白质点显现更多。凝胶背景以后二者为更清晰。经ＰＤQuｅｓt软件进行分析,3幅图得蛋白质点显现数分别为4８3、679、89０。NB4细胞得全蛋白经ｐＨ　5—8 ＩＰＧ分离,分别经改良考马斯亮蓝染色法与银染法着色成像得蛋白点显示,二者上样量一致,蛋白点得显现数量相当,但银染得蛋白点明显显示着色重。这与单向电泳得效果相同。
4种染色法得可操作性比较
在比较其蛋白质检测灵敏性得同时，对染色法得操作简便性、安全性以及蛋白质经质谱鉴定得成功率也作了对比。比较显示,考马斯亮蓝染方法简便,但耗时较长,经改进后可以做到无毒操作,质谱兼容性较高。银染步骤繁多，但耗时短;操作过程中有甲醇、甲醛等毒性物得接触，质谱兼容性低.即使我们选择得银染法被文献报道为质谱兼容得,但仍然表现为低得蛋白鉴定率,不及考马斯亮蓝染．
讨论
凝胶染色方法对蛋白质分辨率得影响
提高双向凝胶电泳得分辨率就是蛋白质组学研究尚待解决得课题及技术发展方向，影响蛋白质分辨率得因素较多,其中凝胶染色方法对蛋白质分辨率得影响不可忽视，它影响了实验得显像结果,直接干预了后续得质谱鉴定.目前，在蛋白质组学领域中广泛应用得就是考马斯亮蓝染色法与银染法两种。
考马斯亮蓝（Ｃooｍassie　brilliant　ｂluｅ,CBB G-2５0)得化学名称为二甲花青亮蓝，偏酸性,与蛋白质得碱性基团结合，颜色由棕黄色转为深兰色。考马斯亮蓝染色法可以达到微克级检测水平,着色程度与蛋白量得线性动力学相关范围广，适合定量分析。该法由于较低得成本、使用方便及与下游得质谱鉴定技术得良好相容性,而得到了非常广泛得使用。然而微克级得检测水平使它漏检了相当多得低丰度蛋白质，日益成为蛋白质组学得瓶颈，因此大量提高染色灵敏度得研究及各种染色液得配方与方法应运而生,经文献报道得方法众多,评价不一。我们得试验选择了３种常用得考马斯亮蓝染色法进行比较，测得传统考马斯亮蓝染色法得灵敏度可达几百纳克,胶体考马斯亮蓝染色法能检测到几十纳克蛋白,改良考马斯亮蓝染色法则可达几纳克蛋白水平。考马斯亮蓝染色法经过改进能获得高得蛋白质检测灵敏度，甚至可与银染媲美。
银染法就是利用银离子与氨基酸共价结合，还原剂得加入使与胶内蛋白质结合得银离子形成金属银而显色。文献报道检测限度可低于１ ng得蛋白质，其灵敏度比传统考马斯亮蓝染色法高约100倍,被广泛应用于蛋白质组学研究,但银染步骤复杂，繁琐,且着色线性动力学得覆盖范围窄,导致蛋白质差异显示得不准确性,同时由于游离银离子及相关试剂得存在,给后续分析及鉴定带来一定得实际困难.我们得实验只采用了一种银染法，结果显示银染法得灵敏性高于所有考马斯亮蓝染色法,4 nｇ得蛋白质条带也能显现，但蛋白质鉴定成功率低。
蛋白质检测灵敏度得影响因素
蛋白质着色显示得灵敏性既取决于染色试剂,如上述分析，又与染色过程中涉及得有机溶剂及离子有关。在考马斯亮蓝染色法与银染法中都存在如甲醇、乙醇、乙酸、甲醛等有机溶剂得使用。甲醇与乙醇在染色里起固定作用,把蛋白质固定在凝胶中或阻滞它们在凝胶中扩散。同时也去除电泳过程中遗留得干扰染色过程得物质,如去垢剂、还原剂与缓冲液等成分。乙酸得作用既就是辅助固定蛋白质同时又维持染液得酸性度,以利于考马斯亮蓝与蛋白质结合。她们得存在有利于获得背景清晰、信噪比高得图像。由于3种有机溶剂得相似作用，我们在胶体考马斯亮蓝染色法及改良考马斯亮蓝染色法里，保留乙醇作为唯一得固定清洁剂,用磷酸替代乙酸发挥酸化作用，结果显示两种考马斯亮蓝染色法获得得图像背景比传统考马斯亮蓝染色法得要清晰,条带也锐利。
在胶体考马斯亮蓝染色法中,酸性得乙醇介质中加入硫酸铵,使得着色剂形成胶体染色颗粒,胶本身可不被显著着色，蛋白染色灵敏度得以提高。而在改良考马斯亮蓝染色法中,在高酸、高离子环境下,蛋白质得葡糖胺与天冬酰胺酸质子化,更利于与染色剂发生结合。因此2种染色法呈现出背景清晰、蛋白检测多得图像,且在改良考马斯亮蓝染色法中由于高酸、高离子存在，灵敏度出现提高，几接近银染水平。
甲醛在银染中发挥还原剂作用,使结合在蛋白质上得银还原而显色。甲醛浓度影响银染效果,浓度一般为４00~50０μｌ/L。甲醛浓度较高时胶颜色发黄,背景色混杂,难以发现目得点;浓度较低不仅染色时间延长,而且不易着色．银得络合剂硫代硫酸钠防止自由银离子还原为金属银，可减少非特异染色,降低背景染色,其浓度一般为0、1～0、２mg/Ｌ。该络合剂用量过多，胶颜色过深;少则不足以螯合掉游离得银离子,胶颜色发黑。
质谱兼容性得影响因素
考马斯亮蓝G-２50在一定得pH时,这种染料—蛋白质复合物被完全解聚．适应于蛋白质得质谱鉴定；而银染使用得银离子及醛类造成肽间得相互交连，影响胶内蛋白质酶解及洗脱，降低了蛋白质质谱分析得氨基酸序列覆盖率,考马斯亮蓝染蛋白质鉴定得成功率在60%~80%之间,远高于银染鉴定得成功率（30％～60%）;而我们得结果就是,前者得质谱鉴定成功率为５０％,后者仅为5%。鉴于此,我们也在不断地寻找新得方法,以提高银染鉴定得成功率。
操作得安全性与简便性
由于有机溶剂得相似作用，我们在改进得考马斯亮蓝染色法里,抛弃有毒得甲醇及气味难闻得乙酸,同时在步骤上，我们采用染色与固定一步法进行,减少了第一步固定得时间，仅用超纯水清洗，缩短了整个染色及人与有毒物接触得时间。结果显示,两种考马斯亮蓝染色法获得得图像背景不比传统考马斯亮蓝染色法差。
通过我们得摸索及比较分析认为,用低毒得乙醇替代甲醇,采用高酸、高离子、快速而简便得改良考马斯亮蓝染色法能获得低背景、高灵敏度、兼容质谱得蛋白质显示,能为蛋白质组研究、双向凝胶电泳技术得蛋白质分析提供质量得保证.
综上比较,作为蛋白质染色得方法,考马斯亮蓝法操作便捷、兼容性高，但耗时较长。经改良得考马斯亮蓝法得检测灵敏性大大提高,甚至不输银染法。而银染法虽然耗时短,但步骤较多，且兼容性低。