金黄色葡萄球菌（第二法）检验方法学验证报告.doc

GB4789.10-2016金黄色葡萄球菌（第二法）方法学验证报告

一、 验证目的
验证《食品安全国家标准 食品微生物学检验 金黄色葡萄球菌检验GB 4789.10-2016》第二法在本实验室的适用性。
二、验证方法
样品采样方案依据GB4789.1-2010 《食品微生物学检验 总则》的要求进行，本实验样品取三个不同的典型样品进行实验，严格按照GB4789.10-2016进行。
表1:实验方法设计表
样品种类
样品名称
样品编号
实验人员
实验方法
蜜饯制品
xxx
xxx
a、b
双人双平行
熟肉制品
xxx
xxx
a、b
双人双平行
调味品品
xxx
xxx
a、b
双人双平行
除上述实验程序外，为保证本次验证的科学性和准确性，本次实验添加阴阳性对照，标准菌株金黄色葡萄球菌（CICC10384）做阳性对照，表皮葡萄球菌（CMCC(B)26069）做阴性对照，与样品实验程序同时进行。
三、验证设备和试剂
1. 冰箱： SC-322 青岛海尔电器
2. 生化培养箱：SPX-150B-Z 上海博迅实业
3. 电位pH计：PHS-3C+（精确度0.01） 成都世纪方舟科技有限公司
4. 恒温振荡器：SHA-A 江苏金坛环宇科学仪器厂
5. 天平：JE-502 上海浦春计量仪器有限公司
6. 显微镜： B203LED 重庆奥特光学仪器
培养基和试剂：
1. 血琼脂平板 北京陆桥技术股份有限公司
2. Baird-Paker琼脂平板 北京陆桥技术股份有限公司
3. 脑心浸出液肉汤（BHI） 北京陆桥技术股份有限公司

4. 兔血浆 北京陆桥技术股份有限公司
5. 革兰氏染液 北京陆桥技术股份有限公司
四、验证环境
1. 依据《消毒与灭菌效果的评价方法与标准GB15981-1995》定期对高压蒸汽灭菌锅的灭菌效果进行检测评价并记录；
2. 依据《无菌室消毒灭菌操作规程》定期对对无菌室、生物安全柜进行清洁消毒灭菌并记录；
3. 依据《实验室质量控制规范食品微生物检测GB/T27405-2008》定期对对无菌室及生物安全柜进行沉降菌检测并记录；
4. 无菌室检验：详见《XXXX》；
五、验证步骤
1操作步骤
1. 1样品的稀释
1.1.1固体和半固体样品:称取25g样品置于盛有225mL 稀释液的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打 1min~2min ，制成1：10的样品匀液。
1.1.2液体样品:以无菌吸管吸取25mL样品置于盛有生理盐水的无菌锥形瓶(瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠)中，充分混匀制成1：10的样品匀液。
1.1.3 用 1mL无菌吸管或微量移液器吸取1：10样品匀液1mL，沿管壁缓慢注于盛有 9mL生理盐水的无菌试管中(注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面)，振摇试管或换用 1 支 1mL无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成1∶100的样品匀液
1.1.4按 1.1.3.操作程序，制备10倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次，换用1次 1mL 无菌吸管或吸头。
1. 2样品的接种
根据对样品污染状况的估计，选择2个~3个适宜稀释度的样品匀液(液体样品可包括原液)，在进行10倍递增稀释的同时，每个稀释度分别吸取1mL样品匀液以0.3mL、0. 3mL、0. 4mL接种量分别加入三块Baird-Parker平板,然后用无菌涂布棒涂布整个平板，注意不要触及平板边缘。使用前，Baird-Parker平板表面有水珠，可放在25℃~50℃的培养箱里干燥,直到平板表面的水珠消失。
1. 3培养
在通常情况下，涂布后将平板静置10min，如样液不易吸收，可将平板放在培养箱 36℃±1℃ 培养1h。等样品匀液吸收后翻转平板，倒置后于36℃±1℃培养 24h~48h。
1. 4典型菌落计数和确认
1. 4. 1金黄色葡萄球菌在Baird-Parker平板上呈圆形，表面光滑、凸起、湿润、菌落直径为 2 mm~3mm，颜色呈灰黑色至黑色，有光泽，常有浅色(非白色)的边缘，周围绕以不透明圈(沉淀)，其外常有一清晰带。当用接种针触及菌落时具有黄油样黏稠感。有时可见到不分解脂肪的菌株，除没有不透明圈和清晰带外，其他外观基本相同。从长期贮存的冷冻或脱水食品中分离的菌落，其黑色常较典型菌落浅些，且外观可能较粗糙，质地较干燥。
1.4.2选择有典型的金黄色葡萄球菌菌落的平板，且同一稀释度3个平板所有菌落数合计在 20CFU~200CFU 之间的平板，计数典型菌落数。
1.4.3从典型菌落中至少选5个可疑菌落(小于5个全选)进行鉴定试验。分别做染色镜检,血浆凝固酶试验;同时划线接种到血平板36℃±1℃培养18h~24h后观察菌落形态，金黄色葡萄球菌菌落较大，圆形、光滑凸起、湿润、金黄色(有时为白色),菌落周围可见完全透明溶血圈。
2结果计算
2.1若只有一个稀释度平板的典型菌落数在20CFU~200CFU之间，计数该稀释度平板上的典型菌落，按式(1 )计算。
2.2若最低稀释度平板的典型菌落数小于20CFU，计数该稀释度平板上的典型菌落,按式( 1 )计算。
2.3若某一稀释度平板的典型菌落数大于200CFU，但下一稀释度平板上没有典型菌落，计数该稀释度平板上的典型菌落,按式(1 )计算。
2.4若某一稀释度平板的典型菌落数大于200CFU，而下一稀释度平板上虽有典型菌落但不在20CFU~200CFU范围内，应计数该稀释度平板上的典型菌落，按式( 1 )计算。
2.5若2个连续稀释度的平板典型菌落数均在20CFU~200CFU之间,按式( 2 )计算。
2.6计算公式
公式（1）：………（1）式中：
T—样品中金黄色葡萄球菌菌落数；
A—某一稀释度典型菌落的总数；
B—某一稀释度血浆凝固酶阳性的菌落数；
C—某一稀释度用于血浆凝固酶试验的菌落数；
d—稀释因子。
公式（2）：…………………（2）式中：
T —样品中金黄色葡萄球菌菌落数；
A1—第一稀释度（低稀释倍数）典型菌落的总数；
A2—第二稀释度（高稀释倍数）典型菌落的总数；
B1—第一稀释度（低稀释倍数）血浆凝固酶阳性的菌落数；
C1—第一稀释度(低稀释倍数)用于鉴定试验的菌落数;
A2—第二稀释度(高稀释倍数)典型菌落的总数;
B2—第二稀释度(高稀释倍数)鉴定为阳性的菌落数;
C2—第二稀释度(高稀释倍数)用于鉴定试验的菌落数;
1.1 —计算系数;d—稀释因子(第一稀释度)。
3报告
根据2中公式计算结果，报告每g ( mL )样品中金黄色葡萄球菌数，以CFU/g ( mL )表示；如 T 值为0 ,则以小于1乘以最低稀释倍数报告。
六、验证结果
实验结果如表2所示，详细实验结果见《金黄色葡萄球菌检验原始记录表》。
表2：金黄色葡萄球菌检验实验结果统计表
组别
样品名称
和编号
实验员
实验结果
平行误差
两组误差
一组
A
XXXX
a
n=5,c=0,T1~T5均<1 CFU/g,未检出
无差异
无差异
a
n=5,c=0,T1~T5均<1 CFU/g,未检出
二组
b
n=5,c=0,T1~T5均<1 CFU/g,未检出
无差异

b
n=5,c=0,T1~T5均<1 CFU/g,未检出
一组
B
XXXX
a
n=5,c=0,T1~T5均<1 CFU/g,未检出
无差异
无差异
a
n=5,c=0,T1~T5均<1 CFU/g,未检出
二组
b
n=5,c=0,T1~T5均<1 CFU/g,未检出
无差异
b
n=5,c=0,T1~T5均<1 CFU/g,未检出
一组
C
XXXX
a
n=5,c=0,T1~T5均<1 CFU/ml,未检出
无差异
无差异
a
n=5,c=0,T1~T5均<1 CFU/ml,未检出
二组
b
n=5,c=0,T1~T5均<1 CFU/ml,未检出
无差异
b
n=5,c=0,T1~T5均<1 CFU/ml,未检出
经过该方法的双人双平行论证，从表2可看出，经过该方法的双人双平行论证，从表2可看出，蜜饯制品-A、熟肉制品-B、调味制品-C的平行误差和两组人员误差均无差异，符合要求。因此可认为《食品安全国家标准 食品微生物学检验 金黄色葡萄球菌检验GB 4789.10-2016》第二法在检测样品中准确可靠，可在本实验室适用，以此类推《食品安全国家标准 食品微生物学检验 金黄色葡萄球菌检验GB 4789.10-2016》的其余类型检品均可适用本标准进行检验。

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