大肠菌群平板计数法方法学验证报告.doc

GB 4789.3-2016大肠菌群平板计数法方法学验证报告

一、 验证目的
验证GB4789.3-2016《食品微生物学检验 大肠菌群计数（大肠菌群平板计数法）》在本实验室的适用性。
二、验证方法
本实验样品取不同不同类型产品进行实验，严格按照GB4789.3-2016进行，本实验方法设计如下：
样品种类
样品名称
样品编号
实验人员
实验方法
包装饮用水
xxx
xxx
c、b
双人双平行
乳粉
xxx
xxx
c、a
双人双平行
豆制品
xxx
xxx
a、b
双人双平行
除上述实验程序外，为保证本次验证的科学性和准确性，本次实验添加阳性对照组，对照组由标准菌株大肠埃希氏菌（CICC10389）接种培养而成，与样品实验程序同时进行。
三、验证设备和试剂
1. 冰箱：BCD-212DG/A 海信（北京）电器
2. 生化培养箱：LRH-70 上海一恒科学仪器
3. 电位pH计：PHS-3C+（精确度0.01） 成都世纪方舟科技有限公司
4. 无菌均质器：SCIENTZ-04 宁波新芝生物科技有限公司
5. 恒温振荡器：SHA-A 江苏金坛环宇科学仪器厂
6. 菌落计数仪：Scan-500 北京五洲东方科技发展有限公司
7. 天平:JE-502 上海浦春计量仪器有限公司
8. 超净工作台:SW-CJ-2FD 上海博迅实业
9. 显微镜：B203LED 重庆奥特光学仪器有限公司
培养基和试剂：
1. 结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA） 北京陆桥技术股份有限公司
2. 煌绿乳糖胆盐（BGLB）肉汤 北京陆桥技术股份有限公司
3. 无菌生理盐水：同GB 4789.3项下制法。
四、验证环境
1. 依据《消毒与灭菌效果的评价方法与标准GB15981-1995》定期对高压蒸汽灭菌锅的灭菌效果进行检测评价并记录；
2. 依据《无菌室消毒灭菌操作规程》定期对对无菌室、超净台进行清洁消毒灭菌并记录；
3. 依据《实验室质量控制规范食品微生物检测GB/T27405-2008》定期对对无菌室及超净台进行沉降菌检测并记录；
4. 无菌室检验：详见《xxxx》；
五、验证步骤
1. 样品的稀释
1.1 固体和半固体样品： 称取 25 g 样品放入盛有 225 mL生理盐水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打 1 min～2 min，制成 1:10 的样品匀液。
1.2 液体样品：以移液枪吸取 25 mL 样品置盛有 225 mL生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成 1:10 的样品匀液。
1.3 样品匀液的 pH值应在 6.5～7.5 之间，必要时分别用 1 mol/L NaOH或 1 mol/L HCl 调节。
 1.4 用 1 mL微量移液器吸取 1:10 样品匀液1 mL，沿管壁缓缓注入 9 mL生理盐水的无菌试管中，振摇试管使其混合均匀，制成 1:100 的样品匀液。
1.5 根据对样品污染状况的估计，按上述操作，依次制成十倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释1 次，换用1支 1 mL 无菌吸头。从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过 15 min。
2. 选取2个～3个适宜的连续稀释度, 每个稀释度接种2个无菌平皿，每皿1 mL。同时取1 mL生理盐水加入无菌平皿作空白对照，取1ml阳性菌液加入无菌平皿作阳性对照。
3. 及时将15 mL～20 mL冷至46℃的结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）约倾注于每个平皿中。小心旋转平皿，将培养基与样液充分混匀，待琼脂凝固后，再加3 mL～4 mLVRBA覆盖平板表层。翻转平板，置于36℃±1℃培养18 h～24 h。
4. 平板菌落数的选择

选取菌落数在 15 CFU～150 CFU之间的平板，分别计数平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落。典型菌落为紫红色，菌落周围有红色的胆盐沉淀环，菌落直径为 0.5 mm或更大。
5. 证实试验
从 VRBA平板上挑取 10个不同类型的典型和可疑菌落，分别移种于 BGLB 肉汤管内，36℃±1℃培养 24h～48h，观察产气情况。凡BGLB肉汤管产气，即可报告为大肠菌群阳性。
6. 大肠菌群平板计数的报告
经最后证实为大肠菌群阳性的试管比例乘以4中计数的平板菌落数，再乘以稀释倍数，即为每g（mL）样品中大肠菌群数。
六、验证结果
实验结果如下表所示，详细实验结果见《食品中大肠菌群平板计数检验原始记录（2010）》。
表1：大肠菌群平板计数检验（2010）实验结果统计表
组别
样品名称
和编号
实验员
实验结果
平行误差
两组误差
一组
A
XXXX
c
5个样品结果均小于m值（m=0CFU/mL）
无明显差异
无明显差异
c
5个样品结果均小于m值（m=0CFU/ mL）
二组
b
5个样品结果均小于m值（m=0CFU/ mL）
无明显差异
b
5个样品结果均小于m值（m=0CFU/ mL）
一组
B
XXXX
a
5个样品结果均小于m值（m=10CFU/g）
无明显差异
无明显差异
a
5个样品结果均小于m值（m=10CFU/g）
二组
c
5个样品结果均小于m值（m=10CFU/g）
无明显差异
c
5个样品结果均小于m值（m=10CFU/g）
一组
C
XXXX
a
2个样品结果位于m和M值之间
（100＜X≤1000CFU/g）
无明显差异
无明显差异
a
2个样品结果位于m和M值之间
（100＜X≤1000CFU/g）
二组
b
2个样品结果位于m和M值之间
（100＜X≤1000CFU/g）
无明显差异　
b
1个样品结果位于m和M值之间
（100＜X≤1000CFU/g）

经过该方法的双人双平行论证，从表1可看出，A/B/C的平行误差和两组人员误差无明显差异，符合要求。因此可认为GB4789.3-2016《食品微生物学检验 大肠菌群计数（大肠菌群平板计数法）》在检测桶装水，乳粉，豆制品的实验中准确可靠，可在本实验室适用，以此类推大肠菌群平板计数检验参数的其余类型检品均可适用本标准进行检验。

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