第六章-兽药残留检测技术--磺胺类1.ppt

一、概述一、概述(i sh)l磺胺类磺胺类(Slfonamides)药物是兽医上较常用的一类药物是兽医上较常用的一类合成抗感染药物合成抗感染药物,具有抗病原体范围广、化学性质具有抗病原体范围广、化学性质稳定、使用方便、易于生产等优点。稳定、使用方便、易于生产等优点。l磺胺药种类繁多磺胺药种类繁多,兽医上常用的有兽医上常用的有10余种余种(图图)。l磺胺药单独使用磺胺药单独使用,病原体易产生耐药性病原体易产生耐药性,与抗菌增效与抗菌增效剂如剂如TMP(甲氧苄啶甲氧苄啶)等联用等联用,抗菌范围扩大抗菌范围扩大,疗效明显疗效明显增强增强,用来治疗畜禽肠道感染、乳腺炎、肺炎等疾病。用来治疗畜禽肠道感染、乳腺炎、肺炎等疾病。l同时同时(tngsh)也被广泛的用作饲料添加剂也被广泛的用作饲料添加剂,用来增肥用来增肥 犊牛和猪。犊牛和猪。第一页，共四十页。吸收后存在吸收后存在(cnzi)形式形式l磺胺药吸收后磺胺药吸收后,一部分在血浆中保持游离状态一部分在血浆中保持游离状态(游离游离型型),一部分与血浆蛋白相结合一部分与血浆蛋白相结合(结合结合(jih)型型),另一部分在另一部分在肝脏中高度乙酰化变成肝脏中高度乙酰化变成乙酰磺胺乙酰磺胺。l游离型游离型具抗菌作用具抗菌作用,且能透过毛细血管进入各种体液和且能透过毛细血管进入各种体液和组织。组织。l结合型结合型无抗菌活性无抗菌活性,也不能透入体液或组织中也不能透入体液或组织中,但结合但结合较疏松较疏松,能不断分解出游离型磺胺。能不断分解出游离型磺胺。l乙酰化乙酰化是磺胺的主要代谢产物是磺胺的主要代谢产物,无抗菌活性。无抗菌活性。第二页，共四十页。体内分布体内分布(fnb)、代谢、代谢l磺胺药在体内分布相当广泛。各种组织和体液均能到达。以磺胺药在体内分布相当广泛。各种组织和体液均能到达。以血液血液中含量中含量最高最高,肝、肾肝、肾次之次之,胸水、腹水、滑膜液、房水中浓度也较胸水、腹水、滑膜液、房水中浓度也较高高,并能并能透过胎盘透过胎盘进入胎儿体内。进入胎儿体内。l磺胺药在磺胺药在神经神经、肌肉肌肉及及脂肪脂肪组织中的含量则组织中的含量则较低较低。l磺胺药主要在肝脏磺胺药主要在肝脏(gnzng)代谢代谢,代谢方式代谢方式有乙酰化、羟基化、结有乙酰化、羟基化、结合等合等,其中以其中以乙酰化为主乙酰化为主。l磺胺药乙酰化后失去抗菌作用磺胺药乙酰化后失去抗菌作用,且在尿中的溶解度降低且在尿中的溶解度降低,易在肾易在肾小管析出结晶小管析出结晶,造成对泌尿道的损害。应注意同服碳酸氢钠造成对泌尿道的损害。应注意同服碳酸氢钠,并增并增加饮水加饮水,可减少或避免其对泌尿道的损害。可减少或避免其对泌尿道的损害。l部分磺胺药及代谢产物在部分磺胺药及代谢产物在肝肝内成为水溶性的内成为水溶性的葡萄糖醛酸结合物葡萄糖醛酸结合物而失去活性。而失去活性。第三页，共四十页。排泄排泄(pixi)l内服难吸收内服难吸收的磺胺的磺胺(hun n)药药,主要由主要由粪便粪便排出排出;l内服易吸收内服易吸收的磺胺药主要通过的磺胺药主要通过肾脏肾脏排泄排泄,通过肾小球滤过或肾通过肾小球滤过或肾小管分泌到达肾小管腔内的药物小管分泌到达肾小管腔内的药物,有一部分被肾小管重吸收。有一部分被肾小管重吸收。重吸收少、排泄快的药物如磺胺异恶唑在尿中浓度较高重吸收少、排泄快的药物如磺胺异恶唑在尿中浓度较高,适用于适用于治疗泌尿道感染。主要由肾小管分泌治疗泌尿道感染。主要由肾小管分泌,重吸收多的药物在尿中浓重吸收多的药物在尿中浓度低度低,但在血中有效浓度维持时间较长但在血中有效浓度维持时间较长,多属长效如多属长效如SMZ、SMM等。等。l磺胺药尚可经肠液、胆汁分泌排出磺胺药尚可经肠液、胆汁分泌排出,也可由乳汁排泄也可由乳汁排泄,但量但量较少较少。第四页，共四十页。常见常见(chn jin)磺胺药磺胺药l磺胺嘧啶磺胺嘧啶l三甲三甲(sn ji)氧苄啶氧苄啶l磺胺二甲嘧啶磺胺二甲嘧啶l磺胺二甲氧嘧啶磺胺二甲氧嘧啶l磺胺喹恶啉磺胺喹恶啉l磺胺噻唑磺胺噻唑l巴喹普林巴喹普林第五页，共四十页。二、样品二、样品(yngpn)处理处理l常用的磺胺类药物常用的磺胺类药物,除少数外除少数外,一般具有以下一般具有以下(yxi)的基本结构的基本结构:磺酰胺基其化学性质可从四部分结构上表现出来其化学性质可从四部分结构上表现出来,即即:磺酰胺基磺酰胺基(SO2NHR)、芳伯氨基芳伯氨基(nj)(NH2)、芳环、芳环、N1及及N4上的取代基。上的取代基。(R=H),两性化合物两性化合物,可溶于酸或碱溶液。可溶于酸或碱溶液。磺酰氨基的磺酰氨基的酸性酸性表现在表现在N1上的活泼氢原子上的活泼氢原子,其酸性其酸性的大小取决于的大小取决于N1上的取代上的取代基基R。R的吸电性越大的吸电性越大,则其则其酸性越强。酸性越强。第六页，共四十页。化学性质化学性质(huxu xngzh)l本类药物本类药物水溶性较低水溶性较低,易溶于极性有机溶剂易溶于极性有机溶剂如乙醇、丙酮、乙如乙醇、丙酮、乙腈、氯仿和二氯甲烷腈、氯仿和二氯甲烷,难溶于非极性有机溶剂难溶于非极性有机溶剂。l由于磺胺药具有酸碱两性由于磺胺药具有酸碱两性,通过调节溶液的通过调节溶液的pH值值(pH79),可以使可以使磺胺药呈不同状态磺胺药呈不同状态,即即中性分子中性分子还是还是离子分子离子分子,从而改变水相和从而改变水相和有机相的分配系数。有机相的分配系数。l例如例如,磺胺的中性分子磺胺的中性分子,在二氯甲烷等有机溶剂中分配系数大在二氯甲烷等有机溶剂中分配系数大;离子态分子离子态分子,则水性溶液中分配系数大。则水性溶液中分配系数大。l生物样品通过生物样品通过多次液多次液-液萃取液萃取(cuq),可达到净化的目的。可达到净化的目的。第七页，共四十页。1、提取、提取(tq)l液体样品液体样品(如牛奶如牛奶)可用水稀释过滤后可用水稀释过滤后,荧光直接检测荧光直接检测,亦可用水性亦可用水性缓冲液或氯化钠溶液稀释缓冲液或氯化钠溶液稀释,再进行净化处理。再进行净化处理。l蜂蜜样品蜂蜜样品可用水或水性缓冲液稀释。可用水或水性缓冲液稀释。l组织样品组织样品(如肌肉、肾脏、肝脏如肌肉、肾脏、肝脏)的预处理相对复杂些的预处理相对复杂些,一般采一般采取均质、液取均质、液-液萃取或固相萃取净化等步骤。液萃取或固相萃取净化等步骤。l液液-液萃取操作烦琐液萃取操作烦琐,而蛋白沉淀后直接进样而蛋白沉淀后直接进样,虽操作简便、并具有虽操作简便、并具有(jyu)较高的回收率较高的回收率,但对色谱柱的损害较为严重。但对色谱柱的损害较为严重。第八页，共四十页。溶剂溶剂(rngj)提取提取l溶剂溶剂(rngj)提取提取时时,应尽可能使组织中应尽可能使组织中结合态结合态的残留物溶解的残留物溶解,并并且除去大部分的蛋白质。且除去大部分的蛋白质。l一般可采用酸性水溶液、乙腈、氯仿、乙酸乙酯、二氯甲一般可采用酸性水溶液、乙腈、氯仿、乙酸乙酯、二氯甲烷、丙酮或混合溶剂等烷、丙酮或混合溶剂等极性溶剂极性溶剂进行提取。进行提取。l二氯甲烷中加入二氯甲烷中加入离子对试剂离子对试剂四丁基铵四丁基铵(pH10),对鱼肉和动物组对鱼肉和动物组织的提取织的提取,发现磺胺二甲氧嘧啶和奥美普林的提取率很高。发现磺胺二甲氧嘧啶和奥美普林的提取率很高。l另外另外,提取过程中加入提取过程中加入无水硫酸钠无水硫酸钠可脱去组织样品中的水分可脱去组织样品中的水分,有助于样品的充分提取。有助于样品的充分提取。第九页，共四十页。2、净化、净化(jnghu)l初提取液中含大量的内源性干扰杂质初提取液中含大量的内源性干扰杂质,在痕量分析时会干扰组在痕量分析时会干扰组分的测定分的测定,因此还需要净化处理。因此还需要净化处理。l净化方法净化方法有液有液-液萃取、固相萃取、基质固相分散、在线痕液萃取、固相萃取、基质固相分散、在线痕量富集、液相色谱、在线透析和超临界流体萃取等。量富集、液相色谱、在线透析和超临界流体萃取等。l有时有时(yush)为了获得高的净化效果为了获得高的净化效果,几种方法相结合应用。几种方法相结合应用。第十页，共四十页。液液-液萃取液萃取(cuq)l液液-液萃取液萃取尽管操作烦琐尽管操作烦琐(fn su)、耗费溶剂、耗费溶剂,但在所有净化方法但在所有净化方法中应用最广。中应用最广。l通过通过调节调节样液的样液的pH值值,使磺胺类药物有选择性地在有机相与水使磺胺类药物有选择性地在有机相与水相之间进行分配。相之间进行分配。l例如例如,有机相提取液中的磺胺类药物可以被强酸溶液或碱性溶液有机相提取液中的磺胺类药物可以被强酸溶液或碱性溶液抽提抽提,若将水相提取液调节若将水相提取液调节pH至至5.15.6,可用二氯甲烷或乙酸乙酯可用二氯甲烷或乙酸乙酯进行再抽提。进行再抽提。l离子对提取法离子对提取法亦有应用亦有应用,例如例如,水相提取液调节水相提取液调节pH至至1011,加加入四丁基铵离子对试剂入四丁基铵离子对试剂,形成磺胺类离子对形成磺胺类离子对,可以被二氯甲烷可以被二氯甲烷提取。提取。l用用正己烷正己烷或或乙醚乙醚进行液进行液-液萃取液萃取,可以可以脱脂肪脱脂肪。第十一页，共四十页。固相萃取固相萃取(cuq)l由于甲氧苄啶常和其他磺胺药物同时由于甲氧苄啶常和其他磺胺药物同时(tngsh)使用使用,而它们具有而它们具有不同的不同的pKa和溶剂亲和力和溶剂亲和力,难以在给定的难以在给定的pH值和溶剂系统中同值和溶剂系统中同时提取时提取,宜采用宜采用固相萃取法固相萃取法(SPE)。l常用的常用的SPE柱柱,如如C18和和C8、硅胶柱、离子交换柱、硅胶柱、离子交换柱、Florisil柱柱和碱性氧化铝柱等。和碱性氧化铝柱等。l该法操作较为简便、并对生物样品具有较高的该法操作较为简便、并对生物样品具有较高的“净化净化”能力能力,可提高方法的提取回收率和精密度。亦可将几种小柱串联应可提高方法的提取回收率和精密度。亦可将几种小柱串联应用用,可获得更高的净化效果。可获得更高的净化效果。l基质固相分散法基质固相分散法目前只使用目前只使用C18吸附剂吸附剂,该方法简便、提取率该方法简便、提取率和净化能力均高和净化能力均高,已应用于鱼肉、牛肉、猪肉和牛奶样品的已应用于鱼肉、牛肉、猪肉和牛奶样品的预处理。预处理。第十二页，共四十页。柱切换柱切换(qi hun)技术技术l在线痕量富集技术在线痕量富集技术可分离可分离/净化牛奶样品净化牛奶样品(yngpn)中中9种磺胺种磺胺类药物：类药物：l磺胺类药物在预富集柱磺胺类药物在预富集柱RP-C18(10m)中被保留浓缩中被保留浓缩,干干扰杂质用淋洗剂洗去后扰杂质用淋洗剂洗去后,预柱中的磺胺类药物再用洗脱液预柱中的磺胺类药物再用洗脱液洗脱洗脱,进入分析柱中分离。进入分析柱中分离。l有研究者将有研究者将TSK凝胶渗透柱和凝胶渗透柱和PLRP-S预富集柱串联使预富集柱串联使用用,用于净化猪组织中的磺胺二甲氧嘧啶、磺胺甲恶唑和甲用于净化猪组织中的磺胺二甲氧嘧啶、磺胺甲恶唑和甲氧苄啶。氧苄啶。第十三页，共四十页。在线在线(zi xin)透析透析l采取采取在线透析、富集的方法在线透析、富集的方法,可测定动物源食品可测定动物源食品(肌肉、肌肉、牛奶和蛋牛奶和蛋)中的中的13种磺胺类药物：种磺胺类药物：l利用纤维素膜选择性渗过分析物利用纤维素膜选择性渗过分析物,到达预富集柱到达预富集柱(C18、XAD-2或或XAD-4),干扰干扰(gnro)杂质用淋洗剂洗去杂质用淋洗剂洗去,浓缩后的分析物被洗脱后浓缩后的分析物被洗脱后,进入分析柱分离。进入分析柱分离。第十四页，共四十页。超临界流体超临界流体(lit)萃取萃取l超临界流体萃取法超临界流体萃取法被用于猪肾脏样品中甲氧苄啶和被用于猪肾脏样品中甲氧苄啶和3种类固醇激素的提取分离种类固醇激素的提取分离(fnl)。lCO2提取时提取时,分析物被保留在柱的进样端分析物被保留在柱的进样端,大部分内大部分内源性干扰物被洗去后源性干扰物被洗去后,分析物和一些极性干扰物用加分析物和一些极性干扰物用加入改性剂的入改性剂的CO2洗脱。洗脱。第十五页，共四十页。三、分析方法三、分析方法l生物样品中磺胺类药物的分析生物样品中磺胺类药物的分析,光谱法光谱法(分光光度法、分光光度法、荧光光谱法荧光光谱法)和和色谱法色谱法（薄层色谱、气相色谱、液相（薄层色谱、气相色谱、液相色谱、超临界流体色谱）具有灵敏、快速、方便等优色谱、超临界流体色谱）具有灵敏、快速、方便等优点。点。l例如：分光光度法测定牛组织中的磺胺例如：分光光度法测定牛组织中的磺胺(hun n)甲甲嘧啶，蜂蜜中的磺胺嘧啶，蜂蜜中的磺胺(hun n)噻唑，奶中的乙酰磺噻唑，奶中的乙酰磺胺胺(hun n)、N-乙酰磺胺二甲嘧啶；乙酰磺胺二甲嘧啶；l薄层色谱法测定动物组织、猪肝、奶中的磺胺甲薄层色谱法测定动物组织、猪肝、奶中的磺胺甲嘧啶，蜂蜜中的磺胺噻唑。嘧啶，蜂蜜中的磺胺噻唑。第十六页，共四十页。1、光谱法、光谱法l光谱法主要用于样品中光谱法主要用于样品中个别磺胺类药物个别磺胺类药物的分析的分析,最常用的方法为最常用的方法为重重氮化氮化-偶合反应分光光度法偶合反应分光光度法。l无无N4取代基的磺胺类药物取代基的磺胺类药物,或或N4为酰氨基的磺胺类药物为酰氨基的磺胺类药物,经水解经水解,在在酸性介质酸性介质中经中经重氮化重氮化后后,可在可在碱性碱性中与酚类中与酚类(如如-萘酚、麝香萘酚、麝香草酚草酚)偶合偶合,在在中性中性中与变色酸偶合中与变色酸偶合,或在或在弱酸性弱酸性中与胺类偶合呈中与胺类偶合呈色色,于空白校正下于空白校正下,在一定波长处测其吸收度。与标准品对照在一定波长处测其吸收度。与标准品对照(duzho),即可测定其含量。即可测定其含量。l最常应用的是酸性偶合试剂最常应用的是酸性偶合试剂,如如N-(1-萘基萘基)乙二胺乙二胺(Bratton Marshall方法方法),测定波长随组分的不同略有不同测定波长随组分的不同略有不同,一般为一般为540545nm,已应用于牛组织和奶中的磺胺二甲嘧啶检测、蜂已应用于牛组织和奶中的磺胺二甲嘧啶检测、蜂蜜中的磺胺噻唑检测。蜜中的磺胺噻唑检测。第十七页，共四十页。l也有应用也有应用1-(-二乙氨基二乙氨基-乙基乙基-氨基氨基)萘萘,优点为偶合形成的偶氮优点为偶合形成的偶氮染料是水溶性的染料是水溶性的,且其吸收系数也较大。这两种偶合试剂遇亚且其吸收系数也较大。这两种偶合试剂遇亚硝酸都能变色硝酸都能变色,所以所以,经重氮化后经重氮化后,应以氨基磺酸盐将剩余的亚硝应以氨基磺酸盐将剩余的亚硝酸分解除去。酸分解除去。l光谱法选择性差光谱法选择性差,但可作为但可作为(zuwi)一种一种筛选法筛选法应用应用,如牛奶中磺如牛奶中磺胺醋酰和磺胺脒啶的筛选测定。胺醋酰和磺胺脒啶的筛选测定。第十八页，共四十页。2、薄层、薄层(bo cn)色谱法色谱法l薄层色谱薄层色谱(TLC)经常作为样品筛选方法。经常作为样品筛选方法。l经薄层色谱分离后的磺胺类药物经薄层色谱分离后的磺胺类药物,可按两种方法进行定量分析：可按两种方法进行定量分析：洗脱定量法洗脱定量法和和薄层扫描定量法薄层扫描定量法。l洗脱定量法：洗脱定量法：从板上洗脱后从板上洗脱后,可按分光光度法可按分光光度法,或与荧光胺、对或与荧光胺、对二甲氨基苯甲醛二甲氨基苯甲醛(ji qun)反应后的比色法反应后的比色法,或重氮化或重氮化-偶合后的偶合后的比色法进行。其中比色法进行。其中,以以重氮化重氮化-偶合法偶合法最好。最好。l但与实际相比但与实际相比,测得值尚低测得值尚低5%15%。结果偏低的主要原因是。结果偏低的主要原因是薄层色谱条件不稳定薄层色谱条件不稳定,吸附剂可能部分损失。板上洗脱后重氮化吸附剂可能部分损失。板上洗脱后重氮化-偶合法如下偶合法如下:第十九页，共四十页。l刮下的薄层用刮下的薄层用1mol/L HCl 10mL提取提取,所得提取液先加所得提取液先加0.1%NaNO2液液1mL,5min后后,再加再加0.5%氨基磺酸铵液氨基磺酸铵液1mL,强烈强烈(qin li)振摇后振摇后,加入加入0.1%N,N-乙基乙基-N(1-萘萘基基)乙二胺草酸盐溶液乙二胺草酸盐溶液1mL,10min后后,用用3cm的吸收池的吸收池,以同法所得的试剂空白为对照以同法所得的试剂空白为对照,于于546mm处处(SMP、SIZ、ST的的max)或或542nm处处为为SM2 、SPZ(磺胺苯磺胺苯吡唑）的吡唑）的max进行测定。进行测定。第二十页，共四十页。薄层扫描薄层扫描(somio)定量法定量法l薄层扫描法（薄层扫描法（TLCS）系指用一定波长的光照射在薄层板上，对薄）系指用一定波长的光照射在薄层板上，对薄层色谱中有紫外或可见吸收的斑点或经照射能激发产生荧光的斑点层色谱中有紫外或可见吸收的斑点或经照射能激发产生荧光的斑点进行扫描，将扫描得到的图谱及积分值用于药品的质量检查的方法。进行扫描，将扫描得到的图谱及积分值用于药品的质量检查的方法。l随着制板、点样、展开等操作的仪器化及仪器性能随着制板、点样、展开等操作的仪器化及仪器性能(xngnng)的的改进，薄层扫描法检测的灵敏度，结果的精密度与准确度均大改进，薄层扫描法检测的灵敏度，结果的精密度与准确度均大大提高。大提高。l与高效液相色谱法相比，具有多通道效应，可同时平行分离分与高效液相色谱法相比，具有多通道效应，可同时平行分离分析多个样品；流动相用量少且选择范围宽、更换方便；固定相析多个样品；流动相用量少且选择范围宽、更换方便；固定相为一次性使用，对样品的预处理要求不高等优点。为一次性使用，对样品的预处理要求不高等优点。第二十一页，共四十页。l应用应用TLC紫外分光光度法进行磺胺类药物定量分析紫外分光光度法进行磺胺类药物定量分析时时,有有7%11%的损失。的损失。l如用无黏合剂的硅胶如用无黏合剂的硅胶,以以0.1mol/L NaOH调糊制板调糊制板,可可以获得较好的回收率。以获得较好的回收率。lTLC的优点是设备简单、可以同时在多块板上点样的优点是设备简单、可以同时在多块板上点样,处理大量样品处理大量样品(yngpn)时间短时间短,适合饲料、组织、体液适合饲料、组织、体液样品的筛选分析。样品的筛选分析。第二十二页，共四十页。3、气相色谱法、气相色谱法l气相色谱法气相色谱法(GC)具有高的灵敏度和选择性具有高的灵敏度和选择性,但由于磺胺类药物但由于磺胺类药物(yow)难挥发难挥发,测定时需要测定时需要衍生化衍生化。l一般用一般用重氮甲烷重氮甲烷甲基化甲基化,或甲基化后再用或甲基化后再用N-甲基甲基-N-三甲基硅烷三甲基硅烷基三氟乙酰胺基三氟乙酰胺(MSTFA)进行进行硅烷化硅烷化或或N-甲基双甲基双(三氟乙酰胺三氟乙酰胺)(MBTFA)乙酰化乙酰化,以增加挥发性以增加挥发性,改善色谱特性改善色谱特性(热稳定性、降低热稳定性、降低极性极性),氢火焰离子化检测器氢火焰离子化检测器测定。测定。l除了甲基化外除了甲基化外,也可利用也可利用水解法水解法将磺胺类药物水解成相应的将磺胺类药物水解成相应的挥发挥发性胺类性胺类,继之以继之以GC法测定法测定,l也可与适宜的也可与适宜的卤化试剂卤化试剂反应反应,生成相应的生成相应的衍生物衍生物,如三氟乙酰化或如三氟乙酰化或七氟丁酰化衍生物等七氟丁酰化衍生物等,以以电子捕获检测器电子捕获检测器测定。测定。第二十三页，共四十页。GC分离分离(fnl)柱柱l磺胺类药物的分离柱可用磺胺类药物的分离柱可用填充柱填充柱和和石英毛细管柱石英毛细管柱,通常毛细管柱通常毛细管柱(DB-5)分离效果更好。分离效果更好。l样品确证样品确证(qu zhn)分析时分析时,一般用一般用质谱检测器质谱检测器测定测定,离子离子源源采用采用化学电离化学电离和和电子轰击电子轰击接口。接口。l多数磺胺类药物含有多数磺胺类药物含有对氨基苯磺酰基对氨基苯磺酰基结构部分结构部分,它们它们的结构差异只是的结构差异只是N1取代基取代基的不同的不同,所以本类药物的质所以本类药物的质谱有许多共有的特征峰谱有许多共有的特征峰,如如m/z 56、l40、108、92、65和和39等碎片离子峰。等碎片离子峰。第二十四页，共四十页。4、超临界色谱法、超临界色谱法lRamsey等用超临界流体色谱法测定猪肾组织中的等用超临界流体色谱法测定猪肾组织中的甲氧苄啶和三种类固醇激素甲氧苄啶和三种类固醇激素,分析柱为分析柱为Spherisorb 5氨基键合柱氨基键合柱,含甲醇的含甲醇的CO2作流动相作流动相,热喷雾电离热喷雾电离(dinl)串联质谱检测器测定串联质谱检测器测定,检测限约检测限约10mg/kg,对于组织和对于组织和奶中奶中g/kg级残留量的检测级残留量的检测,灵敏度不够。灵敏度不够。第二十五页，共四十页。5、高效、高效(o xio)液相色谱法液相色谱法l20世纪世纪80年代以来年代以来,普遍采用普遍采用反相色谱法反相色谱法,使用使用C18、C8和苯基柱和苯基柱,尤以尤以C18应用最广应用最广,以甲醇以甲醇(或乙腈或乙腈)-水水(含醋酸或偏磷酸含醋酸或偏磷酸)系统为系统为流动相流动相,可分离检测数种磺胺类药物及其代谢物可分离检测数种磺胺类药物及其代谢物,样品可用甲样品可用甲醇或碱性缓冲液溶解制备。醇或碱性缓冲液溶解制备。l流动相流动相中加入适量戊磺酸、己磺酸和辛磺酸离子对试剂中加入适量戊磺酸、己磺酸和辛磺酸离子对试剂,可以改变可以改变磺胺类药物的保留时间和改善峰形。磺胺类药物的保留时间和改善峰形。lHPLC的的洗脱方式洗脱方式,一般采用等度洗脱一般采用等度洗脱,若需同时检测数种磺胺类若需同时检测数种磺胺类药物或多种代谢物药物或多种代谢物,可采用梯度洗脱可采用梯度洗脱,通过改变流动相流速或配通过改变流动相流速或配比比,实现在较短的时间内对生物实现在较短的时间内对生物(shngw)样品中混合组分或代谢样品中混合组分或代谢物的分离。物的分离。第二十六页，共四十页。l由于甲氧苄啶分子结构中不含磺酰胺结构由于甲氧苄啶分子结构中不含磺酰胺结构,其碱性其碱性(jin xn)较其他较其他磺胺类药物强磺胺类药物强,在在HPLC分离检测时分离检测时,在在ODS柱上会产生一定的拖柱上会产生一定的拖尾现象尾现象,可采用反相离子对色谱法可采用反相离子对色谱法,以十二烷基磺酸或四丁基以十二烷基磺酸或四丁基铵盐作为反离子铵盐作为反离子,也可使用扫尾剂三乙胺改善其拖尾现象。但离也可使用扫尾剂三乙胺改善其拖尾现象。但离子对色谱法对色谱柱有一定的损害作用子对色谱法对色谱柱有一定的损害作用,应予注意。应予注意。第二十七页，共四十页。l有些用通常的有些用通常的HPLC法难以分离的磺胺类药物法难以分离的磺胺类药物,使用使用-环糊精化学环糊精化学键合固定相很容易达到分离。键合固定相很容易达到分离。l其分离原理其分离原理,是基于当磺胺药物分子接近或透入到是基于当磺胺药物分子接近或透入到-环糊精疏水腔内环糊精疏水腔内时可形成包合物时可形成包合物,改变了磺胺类药物分子的某些理化性质。包合物改变了磺胺类药物分子的某些理化性质。包合物的稳定性与磺胺类药物分子和的稳定性与磺胺类药物分子和-环糊精分子的大小有关环糊精分子的大小有关,与与-环环糊精作用强的磺胺类药物洗脱较难糊精作用强的磺胺类药物洗脱较难,有较长的保留有较长的保留(boli)时间时间;与与-环糊精作用弱的磺胺类药物洗脱容易环糊精作用弱的磺胺类药物洗脱容易,有较短的保留时间有较短的保留时间,据据此此,可将磺胺类药物分离。可将磺胺类药物分离。l本法选择的流动相为磷酸盐缓冲液本法选择的流动相为磷酸盐缓冲液(pH7.0)-甲醇甲醇(85+15),可分离可分离7种种磺胺类药物的混合物。磺胺类药物的混合物。第二十八页，共四十页。紫外检测器紫外检测器l磺胺类药物在磺胺类药物在250290nm波长区间有强的紫外吸收波长区间有强的紫外吸收,因因此此(ync)HPLC的在线检测的在线检测,一般采用紫外检测一般采用紫外检测。l为提高检测灵敏度为提高检测灵敏度,可使用可使用对二甲氨基苯甲醛对二甲氨基苯甲醛(DMAB)柱后柱后衍生化衍生化,于于450nm处紫外处紫外-可见光检测可见光检测,已应用于蛋、奶和已应用于蛋、奶和肌肉组织中肌肉组织中13种磺胺类药物的测定种磺胺类药物的测定,以及动物组织中以及动物组织中6种种磺胺类药物的测定。磺胺类药物的测定。第二十九页，共四十页。荧光荧光(ynggung)检测器检测器l磺胺类药物磺胺类药物(yow)本身具有本身具有弱的荧光弱的荧光特性特性,但荧光检测时但荧光检测时还需要还需要荧光衍生化荧光衍生化。l常用的荧光衍生剂有常用的荧光衍生剂有邻苯二甲醛邻苯二甲醛(OPA)、荧胺荧胺和和巯基乙醇巯基乙醇等。等。l磺胺类药物与磺胺类药物与OPA或其衍生物或其衍生物(如如4-羟基羟基-邻苯二甲醛邻苯二甲醛)在在酸性介质中反应呈现蓝色荧光酸性介质中反应呈现蓝色荧光,检出量可达检出量可达1 10-9810-8mol/mL的浓度范围。的浓度范围。第三十页，共四十页。l荧胺荧胺作为荧光衍生剂作为荧光衍生剂,可选择性地用于具有可选择性地用于具有(jyu)脂肪脂肪族伯胺基团药物共存时芳伯胺药物的微量测定族伯胺基团药物共存时芳伯胺药物的微量测定,其检其检测限量可达测限量可达0.810-9mol/mL。l此外此外,也有人采用也有人采用2,6二氨基吡啶二氨基吡啶作为荧光衍生剂作为荧光衍生剂,其其检出量可达检出量可达10-9 10-10mol/mL。l衍生化方式有柱前衍生化和柱后衍生化。衍生化方式有柱前衍生化和柱后衍生化。第三十一页，共四十页。电化学检测器电化学检测器l亦可使用电化学检测器亦可使用电化学检测器,但在尿中甲氧苄啶代谢物但在尿中甲氧苄啶代谢物的测定中的测定中,与紫外检测与紫外检测(jin c)比较比较,电化学检测器的检电化学检测器的检测灵敏度并无显著提高测灵敏度并无显著提高,且不能同时检测甲氧苄啶。且不能同时检测甲氧苄啶。l若需同时检测甲氧苄啶若需同时检测甲氧苄啶,可通过提高工作电位实现可通过提高工作电位实现,但此时检测灵敏度将显著下降。但此时检测灵敏度将显著下降。第三十二页，共四十页。例子例子(l zi)1lHorie等报道了蜂蜜中等报道了蜂蜜中10种磺胺类药物的种磺胺类药物的LC-UV测定方法。测定方法。l5g蜂蜜样品中加入蜂蜜样品中加入50mL 30%氯化钠溶液氯化钠溶液,用二氯甲烷提取用二氯甲烷提取,提取提取液中加入无水硫酸钠脱水液中加入无水硫酸钠脱水,过过Sep-Pak Florisil固相萃取柱固相萃取柱,用用10mL乙腈乙腈-二氯甲烷二氯甲烷(2+8)淋洗淋洗,用用10mL甲醇甲醇-二氯甲烷二氯甲烷(2+8)洗脱洗脱,浓缩至干浓缩至干,用用1mL流动相溶解流动相溶解(rngji),进样。进样。l色谱柱为色谱柱为LiChrosphere RP-18e(25cm,5m),以以0.05mol/L 磷酸二氢磷酸二氢钠钠-乙腈乙腈(2+1)作流动相作流动相,流速流速0.5mL/min,275nm处紫外检测处紫外检测,能检能检测到蜂蜜中磺胺类药物浓度测到蜂蜜中磺胺类药物浓度50g/kg。第三十三页，共四十页。标准品和蜂蜜标准品和蜂蜜(fn m)样品色谱图样品色谱图1一磺胺噻唑一磺胺噻唑;2一磺胺嘧啶一磺胺嘧啶(m dn);3一磺胺甲嘧啶一磺胺甲嘧啶;4一磺胺甲氧哒嗪一磺胺甲氧哒嗪;5一磺胺二甲嘧啶一磺胺二甲嘧啶;6-磺胺间甲氧嘧啶磺胺间甲氧嘧啶;7一磺胺氯达嗪一磺胺氯达嗪;8一磺胺甲蟋唑一磺胺甲蟋唑;9一磺胺喹嗯啉一磺胺喹嗯啉;10一磺胺二甲氧嘧啶一磺胺二甲氧嘧啶第三十四页，共四十页。例子例子(l zi)2lSimeonido等报道了柱前衍生化离子对色谱法测定鸡肉中等报道了柱前衍生化离子对色谱法测定鸡肉中4种种磺胺类药物。磺胺类药物。l3g组织组织(zzh)样品中加入样品中加入30mL氯仿氯仿,均质均质,离心后上清液过滤离心后上清液过滤,取取10mL滤液加入滤液加入1mL 3mol/L盐酸提取盐酸提取,用荧胺衍生化用荧胺衍生化,色谱柱为色谱柱为Ncleosil 120 C18柱柱(25cm,5m),以以0.02mol/L磷酸盐磷酸盐(pH4)-乙腈乙腈(66+34)含含20mmol/L辛磺酸钠作流动相辛磺酸钠作流动相,流速流速1.2mL/min,荧光检荧光检测测,激发波长激发波长405nm,发射波长发射波长495nm。l在上述条件下在上述条件下,检测限检测限:磺胺嘧啶磺胺嘧啶3g/kg、磺胺二甲嘧啶、磺胺二甲嘧啶4g/kg、磺胺二甲氧嘧啶磺胺二甲氧嘧啶9g/kg、磺胺喹恶啉、磺胺喹恶啉40g/kg。第三十五页，共四十页。标准品和鸡肉样品标准品和鸡肉样品(yngpn)色谱图色谱图1一磺胺一磺胺(hun n)嘧啶嘧啶10g/kg;2一磺胺二甲嘧啶一磺胺二甲嘧啶20g/kg;3一磺胺二甲氧嘧啶一磺胺二甲氧嘧啶30g/kg;4一磺胺喹恶啉一磺胺喹恶啉100g/kgA A磺胺类药物磺胺类药物(yow)(yow)标准品标准品B B空白肌肉空白肌肉CC空白添加样空白添加样第三十六页，共四十页。例子例子(l zi)3lLe Bolaire等采用等采用(ciyng)基质固相分散技术基质固相分散技术LC法分析肌肉组织法分析肌肉组织中中8种磺胺类药物和种磺胺类药物和6种其他药物。种其他药物。l0.5g样品中加入样品中加入C18填料填料,混匀混匀,装入装入10mL小柱中小柱中,用正己烷淋洗用正己烷淋洗,用用8mL二氯甲烷洗脱二氯甲烷洗脱,浓缩至干浓缩至干,用用0.25mL 0.01mol/L醋酸铵醋酸铵(pH5.2)-乙腈乙腈-甲醇甲醇(86+10+4)溶解。溶解。l色谱柱为色谱柱为ODS柱柱(25cm,5m),流动相为流动相为0.01mol/L醋酸盐醋酸盐(pH5.2)和乙和乙腈腈-甲醇甲醇(70+30),梯度淋洗梯度淋洗,流速流速1mL/min,275nm和和365nm处紫外处紫外检测。检测。l在上述条件下在上述条件下,能检测到肌肉组织中药物浓度能检测到肌肉组织中药物浓度3.566g/kg。第三十七页，共四十页。例子例子(l zi)4lWen等采用固相微萃取等采用固相微萃取(SPME)-液相色谱法测定牛奶中液相色谱法测定牛奶中5种磺胺类种磺胺类药物残留。药物残留。l聚聚(甲基丙烯酸甲基丙烯酸-乙二醇二甲基丙烯酸酯乙二醇二甲基丙烯酸酯)毛细管整体柱作为萃取介质毛细管整体柱作为萃取介质,实验优化了影响萃取效率的参数实验优化了影响萃取效率的参数(cnsh)。l样品先用乙醇提取样品先用乙醇提取,再用磷酸盐缓冲液稀释再用磷酸盐缓冲液稀释,离心后将样品溶液直接离心后将样品溶液直接注入注入SPME装置中装置中,在线在线LC分离分离,V检测。浓度在检测。浓度在205000ng/mL(磺磺胺醋酰钠胺醋酰钠1005000ng/mL)范围内范围内,峰面积与浓度的线性相关系数峰面积与浓度的线性相关系数(R2)0.998。l磺胺嘧啶、磺胺甲嘧啶、磺胺甲恶唑、磺胺间甲氧嘧啶钠和磺胺醋磺胺嘧啶、磺胺甲嘧啶、磺胺甲恶唑、磺胺间甲氧嘧啶钠和磺胺醋酰钠的检测限分别为酰钠的检测限分别为2.0ng/mL,2.8ng/mL,1.7ng/mL,2.5ng/mL和和22ng/mL。批内和批间的重复性也显示良好。批内和批间的重复性也显示良好,相对标准偏差分别相对标准偏差分别 10.0%和和9.94%。第三十八页，共四十页。例子例子(l zi)5lGehring等采用等采用LC-APCI-MS法分析鱼组织磺胺法分析鱼组织磺胺(hun n)嘧啶：嘧啶：l样品用乙腈提取样品用乙腈提取,二氯甲烷液二氯甲烷液-液分配液分配,丙磺酸交换柱丙磺酸交换柱和和C18固相萃取柱净化固相萃取柱净化,分析柱为分析柱为Inertsil ODS-2柱柱,以以乙腈乙腈-2%醋酸醋酸(20+80)作流动相作流动相,流速流速lmL/min。第三十九页，共四十页。内容(nirng)总结一、概述。磺胺药吸收后,一部分在血浆中保持游离状态(游离型),一部分与血浆蛋白相结合(结合型),另一部分在肝脏中高度(god)乙酰化变成乙酰磺胺。离子对提取法亦有应用,例如,水相提取液调节pH至1011,加入四丁基铵离子对试剂,形成磺胺类离子对,可以被二氯甲烷提取。洗脱定量法：从板上洗脱后,可按分光光度法,或与荧光胺、对二甲氨基苯甲醛反应后的比色法,或重氮化-偶合后的比色法进行第四十页，共四十页。