体外评价体系介绍.pptx

体外评价体外评价 体外评价是指在活生物体之外的环境中利用细胞、模拟活生物体体外评价是指在活生物体之外的环境中利用细胞、模拟活生物体模型等平台进行的评价。模型等平台进行的评价。在生物评价领域中，体外评价具有以下方面的特点在生物评价领域中，体外评价具有以下方面的特点1 1、符合、符合“3Rs”“3Rs”原则（原则（ReductionReduction，RefinementRefinement、ReplacementReplacement）2 2、检测结果的稳定性好、再现性高、检测结果的稳定性好、再现性高3 3、可为临床评价提供有效的技术支持、可为临床评价提供有效的技术支持体外评价体系的构成体外评价体系的构成评价项目的确立评价项目的确立1 1评价内容的分析评价内容的分析2 2评价方案的建立评价方案的建立3 3最佳评价平台及方法的筛选最佳评价平台及方法的筛选4 4安全性评价安全性评价5 5功效性评价功效性评价6 6评价结果评价结果7 7安全性评价项目安全性评价项目1 1、刺激性评价、刺激性评价 作为动物刺激性实验的代替法，使用作为动物刺激性实验的代替法，使用3T33T3细胞分析评价被检物质的毒性指标。细胞分析评价被检物质的毒性指标。兔角膜细胞兔角膜细胞SIRCSIRC2 2、眼粘膜刺激性评价、眼粘膜刺激性评价 向兔角膜细胞向兔角膜细胞SIRCSIRC 添加被检物质，确添加被检物质，确认刺激性效果，再与标准品对比进行刺激性认刺激性效果，再与标准品对比进行刺激性强度的评价强度的评价3 3、细胞毒性评价、细胞毒性评价 向细胞添加被检物质，确认其对细胞的向细胞添加被检物质，确认其对细胞的损伤情况，判断其毒性作用。损伤情况，判断其毒性作用。4 4、光毒性评价（、光毒性评价（UVUV照射）照射）对经过被检物质处理过的对经过被检物质处理过的BALB/c 3T3BALB/c 3T3小鼠成纤维细胞进行小鼠成纤维细胞进行UVAUVA照射后，以细胞摄取中性红为指标测算出细胞存活率，确定照射后，以细胞摄取中性红为指标测算出细胞存活率，确定50%50%细胞毒性的被检物质浓度（细胞毒性的被检物质浓度（TC50TC50）。）。通过通过UVAUVA（+）、）、UVAUVA（-）照射时的）照射时的TC50TC50应用下列公式计算出应用下列公式计算出PIFPIF值（值（Photo Irritant FactorPhoto Irritant Factor）、）、MPEMPE值可对被检物质的光毒值可对被检物质的光毒性潜能进行评价。可以对单一成分和成品进行评价。性潜能进行评价。可以对单一成分和成品进行评价。UVA UVA(-)(-)UVA UVA(+)(+)样品浓度增加样品浓度增加细胞生存率降低细胞生存率降低1 1、抗氧化应激作用评价、抗氧化应激作用评价 氧化应激（氧化应激（Oxidative StressOxidative Stress，OSOS）是指破坏了强氧化剂和抗氧化）是指破坏了强氧化剂和抗氧化剂的平衡导致的潜在伤害，氧化剂、抗氧化剂平衡的破坏是细胞损伤的剂的平衡导致的潜在伤害，氧化剂、抗氧化剂平衡的破坏是细胞损伤的主要原因。主要原因。皮肤作为机体最外层的保护层，不可避免的受到紫外线与刺激物的皮肤作为机体最外层的保护层，不可避免的受到紫外线与刺激物的作用，使皮肤细胞内的活性氧（作用，使皮肤细胞内的活性氧（Reactive Oxygen Species,ROS Reactive Oxygen Species,ROS）过）过多增加，诱发氧化多增加，诱发氧化 应激作用，成为引起人体细胞老化的潜在因素。应激作用，成为引起人体细胞老化的潜在因素。功效性评价项目功效性评价项目 人体皮肤细胞中氧化应激作用的形成原因人体皮肤细胞中氧化应激作用的形成原因 紫外线照射（紫外线照射（UVAUVA、UVBUVB）过多活性氧的累计（过多活性氧的累计（OH OH、O O2 2-、H H2 2O O2 2、1 1O O2 2 ）过氧化脂质（氧自由基与多聚不饱和脂肪酸反应的产物过氧化脂质（氧自由基与多聚不饱和脂肪酸反应的产物 ）抗氧化应激作用的评价抗氧化应激作用的评价评价方法：评价方法：对细胞进行氧化应激刺激，添加被检物质，通过对细胞生存率对细胞进行氧化应激刺激，添加被检物质，通过对细胞生存率的分析来评估被检物质对氧化应激作用的预防与治疗作用。的分析来评估被检物质对氧化应激作用的预防与治疗作用。评价项目：评价项目：评价消除由下列因素诱发的氧化应激作用的效果评价消除由下列因素诱发的氧化应激作用的效果 UVA UVA、UVBUVB照射照射 抗活性氧（抗活性氧（OH OH、O O2 2-、H H2 2O O2 2、1 1O O2 2 ）过氧化脂质过氧化脂质评价平台：评价平台：正常人体表皮角质形成细胞正常人体表皮角质形成细胞正常人体皮肤成纤维细胞正常人体皮肤成纤维细胞被检物质添加时间点：被检物质添加时间点：氧化应激刺激前氧化应激刺激前氧化应激刺激中氧化应激刺激中氧化应激刺激后氧化应激刺激后角质形成细胞成纤维细胞2 2、抗衰老作用评价、抗衰老作用评价 皮肤的衰老通常分为内在性老化和外源性老化。皮肤的衰老通常分为内在性老化和外源性老化。内在性老化见于暴露和非暴露部位，明显的特征为皱纹和皮肤松弛，内在性老化见于暴露和非暴露部位，明显的特征为皱纹和皮肤松弛，表现为表皮、真皮变薄，表皮真皮连接处变平、弹性纤维和胶原纤维减表现为表皮、真皮变薄，表皮真皮连接处变平、弹性纤维和胶原纤维减少等情况。外源性老化主要发生在皮肤内在性老化的基础上，常由紫外少等情况。外源性老化主要发生在皮肤内在性老化的基础上，常由紫外线等引起，见于面部、颈脖和前臂等光暴露部位，表现为粗深的皱纹、线等引起，见于面部、颈脖和前臂等光暴露部位，表现为粗深的皱纹、异常的色素沉着、毛细血管扩张等。异常的色素沉着、毛细血管扩张等。抗衰老是国内外美容皮肤病学研究的热门主题，对于抗衰老作用的抗衰老是国内外美容皮肤病学研究的热门主题，对于抗衰老作用的评价，本实验室采用国际通用综合评价模式（体外评价评价，本实验室采用国际通用综合评价模式（体外评价+人体评价）。在人体评价）。在体外对被检物质的抗衰老效果进行评价，取得的评估结果可为人体评价体外对被检物质的抗衰老效果进行评价，取得的评估结果可为人体评价提供参考依据。提供参考依据。评价平台：评价平台：正常人体表皮角质形成细胞正常人体表皮角质形成细胞正常人体皮肤成纤维细胞正常人体皮肤成纤维细胞化学反应检测化学反应检测 促进胶原蛋白合成作用评价促进胶原蛋白合成作用评价表皮表皮基底层基底层真皮真皮皮肤基底层附近胶原蛋白示意图皮肤基底层附近胶原蛋白示意图4 4型胶原蛋白型胶原蛋白7 7型胶原蛋白型胶原蛋白1 1型胶原蛋白型胶原蛋白1型胶原蛋白：存在于真皮的细胞外基质中，形成三股螺旋结构4型胶原蛋白：多数存在于真皮与表皮之间的基底层中，起到支撑基底层结构的作用7型胶原蛋白：以环状结构与基底层相连接，维持真皮基质的结构 对被检物质是否能提高人体皮肤成纤维细胞的对被检物质是否能提高人体皮肤成纤维细胞的1型胶原蛋白合成作用型胶原蛋白合成作用进行评价。伴随年龄的增加及外界环境的影响，皮肤内的进行评价。伴随年龄的增加及外界环境的影响，皮肤内的1型胶原蛋白含型胶原蛋白含量会减少，从而形成皱纹和皮肤松弛。本评价项目，通过向人体皮肤成量会减少，从而形成皱纹和皮肤松弛。本评价项目，通过向人体皮肤成纤维细胞添加被检物质后，测定细胞内纤维细胞添加被检物质后，测定细胞内1型胶原蛋白合成量（型胶原蛋白合成量（ELISA法），法），根据结果评定被检物质是否具有促进胶原蛋白合成的作用。根据结果评定被检物质是否具有促进胶原蛋白合成的作用。胶原酶活性阻碍作用胶原酶活性阻碍作用 胶原酶是一种能水解胶原蛋白的三维螺旋结构的分解酶。体内胶原酶胶原酶是一种能水解胶原蛋白的三维螺旋结构的分解酶。体内胶原酶会随年龄的增加以及外界环境的作用下，促进其活性的增加，从而加速其会随年龄的增加以及外界环境的作用下，促进其活性的增加，从而加速其对胶原蛋白的分解，破坏皮肤结构，出现皱纹、皮肤松弛等皮肤衰老迹象。对胶原蛋白的分解，破坏皮肤结构，出现皱纹、皮肤松弛等皮肤衰老迹象。让胶原酶与添加了被检物质的胶原蛋白反应，测定胶原蛋白的分解程让胶原酶与添加了被检物质的胶原蛋白反应，测定胶原蛋白的分解程度，通过实验结果分析被检物质是否具有阻碍胶原酶活性增加的作用，评度，通过实验结果分析被检物质是否具有阻碍胶原酶活性增加的作用，评估被检物质的衰老作用。估被检物质的衰老作用。弹性蛋白酶阻碍作用弹性蛋白酶阻碍作用 弹性蛋白酶作用是分解维持肌肤张力的弹性蛋白。随着年龄增弹性蛋白酶作用是分解维持肌肤张力的弹性蛋白。随着年龄增加、过多活性氧的堆积促进弹性蛋白酶分解弹性蛋白，是形成皮肤加、过多活性氧的堆积促进弹性蛋白酶分解弹性蛋白，是形成皮肤衰老的因素之一。因此，阻碍弹性蛋白酶活性，可恢复肌肤张力，衰老的因素之一。因此，阻碍弹性蛋白酶活性，可恢复肌肤张力，起到抗衰老的作用。起到抗衰老的作用。让弹性蛋白酶与添加了被检物质的弹性蛋白反应，测定弹性蛋让弹性蛋白酶与添加了被检物质的弹性蛋白反应，测定弹性蛋白的分解程度，通过实验结果分析被检物质是否具有阻碍弹性蛋白白的分解程度，通过实验结果分析被检物质是否具有阻碍弹性蛋白酶活性增加的作用，评估被检物质的衰老作用。酶活性增加的作用，评估被检物质的衰老作用。促进玻尿酸合成作用评价促进玻尿酸合成作用评价 玻尿酸是一种高分子的多醣体，是由葡萄醛酸玻尿酸是一种高分子的多醣体，是由葡萄醛酸-N-N-乙酸氨基葡萄乙酸氨基葡萄糖为双糖分子单位组成的直链高分子多醣，平均分子量介于糖为双糖分子单位组成的直链高分子多醣，平均分子量介于1010万到万到10001000万万DaltonDalton之间，存在于人体皮肤组织中，填充在细胞与胶原纤维之间，存在于人体皮肤组织中，填充在细胞与胶原纤维的空间中。具有保持皮肤弹性功能，锁住大量水分子，对组织具有保的空间中。具有保持皮肤弹性功能，锁住大量水分子，对组织具有保湿润滑作用，使肌肤饱满年轻有弹性。湿润滑作用，使肌肤饱满年轻有弹性。但随着老化及年龄的增长，玻尿酸流失速度比生长速度快时，肌但随着老化及年龄的增长，玻尿酸流失速度比生长速度快时，肌肤也逐渐变得缺乏水分，失去光泽弹性，出现皱纹等老化现象。肤也逐渐变得缺乏水分，失去光泽弹性，出现皱纹等老化现象。本评价项目，通过向人体皮肤成纤维细胞或人体表皮角质形成细本评价项目，通过向人体皮肤成纤维细胞或人体表皮角质形成细胞添加被检物质后，测定细胞内玻尿酸合成量（胞添加被检物质后，测定细胞内玻尿酸合成量（ELISAELISA法），根据结法），根据结果评定被检物质是否具有促进玻尿酸合成的作用。果评定被检物质是否具有促进玻尿酸合成的作用。3 3、美白作用评价、美白作用评价 美白是指抑制由紫外线照射所生成的黑色素，防止色斑的产生，美白是指抑制由紫外线照射所生成的黑色素，防止色斑的产生，恢复肌肤的原本色泽。黑色素是存在于人体皮肤基底层，在紫外线照恢复肌肤的原本色泽。黑色素是存在于人体皮肤基底层，在紫外线照射下会产生变化，生成一种保护皮肤的物质，然后黑色素又经细胞代射下会产生变化，生成一种保护皮肤的物质，然后黑色素又经细胞代谢，逐步到达肌肤表皮层，形成色斑和色素沉淀等问题。谢，逐步到达肌肤表皮层，形成色斑和色素沉淀等问题。美白化妆品可排除皮肤细胞中积累的过美白化妆品可排除皮肤细胞中积累的过多黑色素，具有淡化色斑、色素沉淀的作用。多黑色素，具有淡化色斑、色素沉淀的作用。美白作用评价是通过多种美白评估法，美白作用评价是通过多种美白评估法，分析美白成分、美白产品对由紫外线引起的分析美白成分、美白产品对由紫外线引起的色斑的改善效果以及色素沉淀的抑制效果，色斑的改善效果以及色素沉淀的抑制效果，客观、有效的评价其美白功效客观、有效的评价其美白功效色素沉淀及色斑生成示意图色素沉淀及色斑生成示意图 黑色素生成抑制作用黑色素生成抑制作用 黑色素细胞受到紫外线照射后，启动人体保护机制生成黑色素，黑色素细胞受到紫外线照射后，启动人体保护机制生成黑色素，黑色素吸收紫外线的作用避免皮肤细胞受到损伤。但持续的照射促进黑色素吸收紫外线的作用避免皮肤细胞受到损伤。但持续的照射促进了黑色素细胞活性，导致生成了过量的黑色素，从而在皮肤上形成了了黑色素细胞活性，导致生成了过量的黑色素，从而在皮肤上形成了色素沉淀与色斑。因此，化妆品成分、产品的黑色素生成抑制作用是色素沉淀与色斑。因此，化妆品成分、产品的黑色素生成抑制作用是评价其美白功效的重要参数之一。评价其美白功效的重要参数之一。本评价项目，将被检验物质添加到黑色素瘤细胞培养，测定黑色本评价项目，将被检验物质添加到黑色素瘤细胞培养，测定黑色素瘤细胞生成的黑色素含量，分析其抑制黑色素生成的能力，评估其素瘤细胞生成的黑色素含量，分析其抑制黑色素生成的能力，评估其美白作用的功效。美白作用的功效。评价平台：评价平台：B16BL6B16BL6 小鼠黑色素瘤细胞小鼠黑色素瘤细胞样品处理后黑色素生成效果样品浓度样品浓度 小小 大大黑色素抑制效果黑色素抑制效果 小小 大大 酪氨酸酶活性阻碍作用酪氨酸酶活性阻碍作用 酪氨酸酶（酪氨酸酶（TyrosinaseTyrosinase）是黑色素合成的关键酶。对酪氨酸酶活性进）是黑色素合成的关键酶。对酪氨酸酶活性进行阻碍可抑制黑色素的生成。行阻碍可抑制黑色素的生成。本评价项目将被检物质与标准物质进行酪氨酸酶活性阻碍效果对比，本评价项目将被检物质与标准物质进行酪氨酸酶活性阻碍效果对比，以及被检物质浓度与阻碍效果关系的分析。以及被检物质浓度与阻碍效果关系的分析。黑色素形成途径以及酪氨酸酶活性作用黑色素形成途径以及酪氨酸酶活性作用 黑色素分解作用黑色素分解作用维生素维生素C C的黑色素分解效果的黑色素分解效果实验操作示意图实验操作示意图 持续受到刺激的黑色素细胞会生成过多的黑色素，形成色斑与持续受到刺激的黑色素细胞会生成过多的黑色素，形成色斑与色素沉淀。具有黑色素分解作用的美白化妆品可淡化由黑色素引起色素沉淀。具有黑色素分解作用的美白化妆品可淡化由黑色素引起的色斑，缓解色素的沉淀。的色斑，缓解色素的沉淀。本评价项目，通过酪氨酸酶的酶作用将酪氨酸本评价项目，通过酪氨酸酶的酶作用将酪氨酸 合成为黑色素，合成为黑色素，然后添加被检物质测定其黑色素分解效果，根据结果对其黑色素分然后添加被检物质测定其黑色素分解效果，根据结果对其黑色素分解能力进行评估。解能力进行评估。4 4、DNADNA损伤修复作用评价损伤修复作用评价 环丁烷嘧啶二聚体增加的抑制作用环丁烷嘧啶二聚体增加的抑制作用 环丁烷嘧啶二聚体（环丁烷嘧啶二聚体（Cyclobutane Pyrimidine Cyclobutane Pyrimidine Dimer,CPDDimer,CPD）是）是DNA DNA 受受UVB UVB 照射后造成的主要伤害照射后造成的主要伤害形式形式 。使用正常的人体细胞测试被检物质能否抑制。使用正常的人体细胞测试被检物质能否抑制由由UVBUVB照射诱发的照射诱发的CPDCPD的增加，从而评价其的增加，从而评价其DNADNA损伤修损伤修复的作用。复的作用。皮肤在皮肤在UVBUVB照射作用下，照射作用下，DNADNA分子吸收光能量后，造成分子吸收光能量后，造成DNADNA损伤损伤。如不及时修复受损。如不及时修复受损DNADNA，会引起，会引起DNADNA结构的变化，阻碍结构的变化，阻碍DNADNA的复制的复制和转录。诱发机体的光老化，严重者导致皮肤癌。和转录。诱发机体的光老化，严重者导致皮肤癌。CPDCPD结构式结构式 COMET AssayCOMET Assay（彗星测定）（彗星测定）COMET Assay COMET Assay（彗星测定）也称为单细胞凝胶电泳测定技术，（彗星测定）也称为单细胞凝胶电泳测定技术，它是一种敏感单链或双链它是一种敏感单链或双链DNADNA突变和破损的遗传测定方法。突变和破损的遗传测定方法。DNA DNA发生解螺旋，损伤的发生解螺旋，损伤的DNADNA断链及片段被释放出来，由于这些断链及片段被释放出来，由于这些DNADNA的分子量很小，所以在电泳过程中会离开核的分子量很小，所以在电泳过程中会离开核DNADNA向阳极移动，形向阳极移动，形成彗星状的图像，而未损伤的成彗星状的图像，而未损伤的DNADNA部分保持球形。部分保持球形。DNA DNA受损越严重，产生的断片越多并受损越严重，产生的断片越多并且片段越小，电泳时迁移的且片段越小，电泳时迁移的DNADNA量也就越量也就越大，迁移距离越长，荧光显微镜下可观察大，迁移距离越长，荧光显微镜下可观察到尾长增加、尾部荧光强度增强。可用于到尾长增加、尾部荧光强度增强。可用于 DNADNA损伤预防及修复作用的评价。损伤预防及修复作用的评价。UVBUVB照射后照射后样品样品 COMET Assay COMET Assay 结果结果三维仿真皮肤组织模型三维仿真皮肤组织模型 三维仿真皮肤是由正常人体成纤维细胞与人体角朊细胞构成，可三维仿真皮肤是由正常人体成纤维细胞与人体角朊细胞构成，可作为代替动物实验的仿真皮肤组织。作为代替动物实验的仿真皮肤组织。主要应用于医药制品、食品、化妆品等成分的刺激性、急性毒性、主要应用于医药制品、食品、化妆品等成分的刺激性、急性毒性、美白效果的评定，比传统的皮肤实验，其稳定性好，再现性高。美白效果的评定，比传统的皮肤实验，其稳定性好，再现性高。3D-Skin 3D-Skin 实物图实物图3D-Skin 3D-Skin 剖面示意图剖面示意图角质层角质层表皮表皮真皮真皮培养基培养基体外评价相关仪器体外评价相关仪器紫外分光光度计紫外分光光度计酶标仪酶标仪奥林巴斯倒置荧光显微镜奥林巴斯倒置荧光显微镜体外评价相关仪器体外评价相关仪器Bio-Rad Bio-Rad 凝胶电泳凝胶电泳Eppendorf 5804R Eppendorf 5804R 冷冻离心机冷冻离心机