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嗜酸粒细胞凋亡与支气管哮喘

　　摘要:　现已明确细胞凋亡是人体清除衰老和不需要的细胞的正常生理过程，一些学者认为嗜酸粒细胞凋亡的异常可能是支气管哮喘病人气道嗜酸粒细胞持续存在、活化、细胞内生物活性物质释放的主要原因，因而是支气管哮喘的重要发病机制之一。本文就嗜酸粒细胞凋亡与支气管哮喘的关系方面的研究进展作一介绍。
　　细胞的死亡有两种形式，一种是人们所熟悉的坏死(necrosis)，另一种是细胞凋亡(apoptosis)或细胞程序性死亡(programmed cell death)。当细胞在外界物理、化学、生物性的损伤因素作用下肿胀变性，发生坏死，细胞内容物释放到细胞的周围环境[1]。而细胞凋亡则是机体细胞一种固有的生理死亡机制，凋亡的细胞能够迅速被吞噬细胞所吞噬，并不释放其胞内的内容物，细胞凋亡对于清除人体不必要的细胞、维持人体细胞群体数量起着重要的作用。现已知道，外周血嗜酸粒细胞升高，气道嗜酸粒细胞持续存在并且释放胞内的嗜酸粒细胞持续存在并且释放胞内的嗜酸性阳离子蛋白(eosinophil cationic protein，ECP)、主要碱性蛋白(major basic protein，MBP）、白三烯C4(leukotriene c4，LTC4)等介质是诱发支气管哮喘的重要的发病机制。目前不少学者认为上述机制可能与嗜酸粒细胞的异常凋亡有关。本文就嗜酸粒细胞凋亡的研究进展及其与支气管哮喘的相关性作一综述。
　　嗜酸粒细胞凋亡的形态学改变及其检测
　　嗜酸粒细胞凋亡过程中的形态学变化同其他类型的细胞如胸腺细胞、中性粒细胞等一样，也是一个连续的过程。首先，凋亡的细胞发生皱缩，细胞膜表面形成许多泡状突起，同时细胞核浓缩，核染色质致密，沿核膜形成新月形，然后泡状突起逐渐扩大缢断，脱离细胞，形成凋亡小体(apoptosis body)。电镜下整个过程胞膜完整，胞浆内细胞器结构正常，胞内内容物没有释放到细胞周围环境。
　　凋亡的嗜酸粒细胞的DNA被自身产生的核酸内切酶切断，切成与180bp成倍数关系的DNA片段，应用琼脂糖凝胶电泳可呈现特征性的“梯状”(Ladder)条纹。也有许多学者应用末端脱氧核苷酸转移酶介导的采用荧光或生物素标记dUTP的末端标记技术(TUNEL，TdT-mediated nick and labelling)，应用荧光显微镜或免疫组化法检测。
　　嗜酸粒细胞凋亡的调节及其与支气管哮喘的关系
　　细胞因子　现已明确白介素(interleukin，IL)-5，IL-3和粒细胞-巨噬细胞集落因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GMCSF)是调节嗜酸粒细胞成熟、分化、趋化、活化不可缺少的细胞因子。支气管哮喘病人外周血及支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)中的这些细胞因子的表达水平明显增加，故新近许多学者就嗜酸粒细胞凋亡以及与这些细胞因子的关系开展了研究[3,5,6]。研究结果表明，正常人和支气管哮喘、过敏性鼻炎等嗜酸粒细胞增高疾病的病人新鲜分离的外周血嗜酸粒细胞在体外培养时，均在第6～12小时出现凋亡的征象，到第4天时绝大多数发生了凋亡，而当培养基中加入IL-5、IL-3、GM-CSF等细胞因子后，到48小时时尚未观察到凋亡的征象。IL-5、GM-CSF可使嗜酸粒细胞的生存延长至10天左右才发生凋亡，而作用较弱的IL-3也可使50％的嗜酸粒细胞生存6天[3,5]。Yousefi等在研究中发现IL-5、IL3、GM-CSF等细胞因子与相应的受体结合时，共同的β亚单位磷酸化后通过酪氨酸激酶通路，进一步依次激活酪氨酸激酶Lyn和Syk，从而参与了抑制凋亡信号的传递，应用Lyn、Syk的反义寡聚核苷酸可抑制IL-5、IL-3等细胞因子的抗凋亡作用。这些细胞因子抑制凋亡信号传递的最终效应可能是通过增强嗜酸粒细胞某种蛋白质的mRNA的转录和蛋白合成而发挥作用。转录抑制剂放线菌素D(actinomycin，ACTD)或蛋白合成抑制剂放线菌酮(cycloheximide，CHX)可拮抗IL-5的抑制调亡作用。Yamaguchi认为嗜酸粒细胞在这些细胞因子的作用下产生一些 蛋白质，能够抑制核内酶的活化，从而抑制了嗜酸粒细胞的凋亡。
　　转化生长因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)　是一种多向性作用的细胞因子，据认为能够促进局部组织细胞的功能而抑制游走的组织内炎症细胞的生长和活性。因而有人就TGF-β对嗜酸粒细胞炎症的作用进行了研究，结果表明，TGF-β可能通过抑制嗜酸粒细胞对IL-5、GM-CSF等细胞因子的自分泌作用，从而诱导促进了嗜酸粒细胞的凋亡；而抗TGF-β抗体则可能通过抑制嗜酸粒细胞对TGF-β的自分泌作用，延长了嗜酸粒细胞的生存时间。这一研究结果提示应用TGF-β可能是治疗支气管哮喘的一个有效方法。
　　茶碱　茶碱是治疗支气管哮喘的常用药物传统上认为它是通过抑制气道平滑肌细胞内磷酸二酯酶的活性，增加细胞内cAMP的使平滑肌舒张的作用，达到止喘效果。但近来的研究发现它能通过促进嗜酸粒细胞凋亡，下调气道嗜酸粒细胞炎症而在支气管哮喘的治疗中发挥作用。Ohta对11例嗜酸粒细胞增高的病人(其中包括6例支气管哮喘病人)的外周血嗜酸粒细胞的研究中发现，茶碱本身并不能促进嗜酸粒细胞的凋亡，但治疗浓度的茶碱(18μg/L)能够明显抑制IL-5对嗜酸粒细胞的作用，促进了嗜酸粒细胞的凋亡。同时，cAMP的类似物双丁酰环磷酸腺苷(dibutyryl cAMP)也起着类似的作用。Hallsworth等[10]进一步的研究表明GM-CSF抑制嗜酸粒细胞凋亡的作用可被能引起嗜酸粒细胞胞内cAMP升高的因素如霍乱毒素所逆转，蛋白激酶A(protein kinase，PKA)的抑制剂H89能抑制霍乱毒素对嗜酸粒细胞的促进凋亡效应。以上研究结果提示，茶碱通过增加胞内cAMP，激活A激酶通路抑制支气管哮喘病人IL-5、IL-3、GM-CSF等细胞因子对嗜酸粒细胞的作用，促进嗜酸粒细胞的凋亡，从而有利于支气管哮喘病人清除气道过多的嗜酸粒细胞。
　　糖皮质类固醇激素　糖皮质类固醇激素应用于支气管哮喘的治疗已有悠久的历史，但其确切的作用机制究竟是什么，尚未明确。体外研究的结果已经提示了糖皮质类固醇激素能够加速嗜酸粒细胞的凋亡，并且能拮抗IL-5、IL-3GM-CSF等细胞因子的效应[10]。而Wooley等[12]对发作期支气管哮喘病人的研究发现，病人在应用糖皮质类固醇激素后症状改善的同时，痰中嗜酸粒细胞计数明显下降，发生凋亡的嗜酸粒细胞的比例由发作期的9±%上升至治疗后的51±10％。Schleimer[11]认为糖皮质类固醇激素对嗜酸粒细胞的效应可能是通过拮抗IL-5、IL-3、GM-CSF等细胞因子介导的转录因子的作用或抑制嗜酸粒细胞对这些细胞因子的自分泌作用，或者减少这些细胞因子受体的表达，从而促进了嗜酸粒细胞的凋亡和清除。
　　Fas和抗Fas　现已明确Fas、APO-1、CD95是同一种分子，它是由325个氨基酸组成的跨膜糖蛋白，属于TNF受体/NGF受体超家族的一员，具有传递信号的功能。Fas可表达于多种细胞的细胞膜，如活化的淋巴细胞、中性粒细胞等。这些细胞表面的Fas被交联、激活后可促进它们的凋亡，从而维持体内新旧细胞交替的稳定性。近来，Hebestreit等的研究发现，尽管患者支气管哮喘和其他一些嗜酸粒细胞增高的病人和正常人新鲜分离的外周血以及组织中的嗜酸粒细胞表面均表达一数量的Fas，胞浆中均可检测到Fas的mRNA，但两者之间并无差异。嗜酸粒细胞凋亡时，Fas表达增加，抗Fas抗体能够促进嗜酸粒细胞的凋亡[13,14]，应用IL-5并不能阻断其促进凋亡的作用[13]，糖皮质类固醇激素则可加强其效应[14]Hebestreit在研究中还发现一些支气管哮喘等嗜酸粒细胞增高的疾病病人外周血和鼻息肉(组织中嗜酸粒细胞增多)的一些嗜酸粒细胞细胞膜表面Fas的表达并无明显异常，但是抗Fas并不能促进这些嗜酸粒细胞的凋亡。以上对Fas的研究表明了嗜酸粒细胞的凋亡。以上对Fas的研究表明了嗜酸粒细胞的凋亡可能与Fas抗原有关；抗Fas促进凋亡和IL-5抑制凋亡是相互独立的过程；支气管哮喘等嗜酸粒细胞增多的病人其嗜酸粒细胞可能不表达功能性的Fas而影响了嗜酸粒细胞的正常凋亡过程。
　　凋亡嗜酸粒细胞的清除　凋亡的嗜酸粒细胞如不能及时得到清除，其细胞膜将失去完整性而进入坏死阶段，释放胞内的生物活性物质。因而对于已经发生凋亡的嗜酸粒细胞及时进行清除的是嗜酸粒细胞炎症消散、支气管哮喘病 人症状好转的重要环节[11]。吞噬细胞对凋亡细胞和凋亡小体的吞噬是消除凋亡嗜酸粒细胞的主要途径，这些细胞包括单核细胞来源的巨噬细胞、上皮细胞以及成纤维细胞等。其中以单核细胞来源的巨噬细胞对凋亡嗜酸粒细胞的识别和吞噬作用最为重要。这些巨噬细胞能够分泌一种多功能的含有Arg-Gly-Asp(RGD)的血小板凝血酶致敏蛋白(thrombospondin，TSP)[15]，TSP能同巨噬细胞表面的整合素αvβ3和CD36抗原相结合，另一方面能同时发生凋亡的嗜酸粒细胞表面相应的受体结合，从而完成凋亡嗜酸粒细胞的识别和吞噬。针对CD36、αvβ3和TSP的单克隆抗体可阻断巨噬细胞的吞噬作用。这些巨噬细胞对于新鲜分离的嗜酸粒细胞并无吞噬作用，其吞噬仅限于已发生凋亡的嗜酸粒细胞。在整个吞噬过程中嗜酸粒细胞的胞膜是完整的，巨噬细胞不因为吞噬凋亡的嗜酸粒细胞而释放炎症介质[14]。临床上，在支气管哮喘病人应用激素病情好转的同时，发生凋亡的嗜酸粒细胞增多，其气道内含有嗜酸粒细胞颗粒的巨噬细胞明显增多[11]。
　　综上所述，嗜酸粒细胞凋亡的异常可能是支气管哮喘的重要发病机制，促进其凋亡将是支气管哮喘新的治疗思路。

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