平痫冲剂对PTZ致痫大鼠中枢神经系统-NMDAR1和GABAARα1的影响.docx

平痫冲剂对ＰＴＺ致痫大鼠中枢神经系统 ＮＭＤＡＲ１和ＧＡＢＡＡＲα１的影响
【摘要】 目的：探讨平痫冲剂抗癫痫的机制。方法：腹腔注射戊四唑制成慢性癫痫模型，通过免疫组织化学方法和显微图像分析技术检测大鼠颞叶及海马齿状回的谷氨酸受体和γ－氨基丁酸受体免疫反应的阳性细胞数、阳性细胞面积比及阳性细胞积分吸光度。结果：与正常对照组比较，模型组颞叶及齿状回ＮＭＤＡＲ１ 的阳性细胞数、阳性细胞面积比上升，阳性细胞积分吸光度增加；而西药治疗组及中药小、中、大剂量组与模型组比较，颞叶及齿状回的ＮＭＤＡＲ１阳性细胞数、阳性细胞面积比都有不同程度地下降，阳性细胞积分吸光度也有不同程度地减少。与正常对照组比较，模型组颞叶及齿状回ＧＡＢＡ ＡＲα１阳性细胞数、阳性细胞面积比下降，阳性细胞积分吸光度降低；而西药治疗组和中药小、中、大剂量组与模型组比较，颞叶及齿状回的ＧＡＢＡ ＡＲα１阳性细胞数、阳性细胞面积比都有不同程度地增加，阳性细胞积分吸光度也有不同程度地升高。结论：平痫冲剂抗癫痫的作用机制可能是通过抑制颞叶及齿状回兴奋性神经递质受体ＮＭＤＡＲ１的活性与表达，并激活其抑制性神经递质受体ＧＡＢＡ ＡＲα１的活性与表达，从而降低大脑皮质的兴奋性，有效抑制癫痫的形成及发展。
【关键词】 癫痫 平痫冲剂 ＰＴＺ点燃型癫痫大鼠模型 ＮＭＤＡＲ１ ＧＡＢＡＡＲα１
癫痫是一种常见的慢性脑部疾病，全世界约有４千万人受累。我国癫痫的患病率约为３．３ ‰ ～ ５．８ ‰，其中儿童癫痫的发病率约为成人的１０倍，且半数以上在１０岁以内起病［１］。该病严重影响患者的生活、工作、学习，且可能在发作时遭遇危险而危及生命，还会伴有一系列复杂的社会心理问题，给患者、家庭及社会带来很大负担［２］。因此如何正确、有效地防治癫痫已成为医学界尤其是儿科界广泛关注的问题。平痫冲剂为恩师张士卿教授依据中医理论，凭借多年临床经验总结所得，并经长期的临床运用，证明确有疗效。本实验通过检测大鼠颞叶氨基酸类神经递质受体的含量，来探讨平痫冲剂对癫痫的治疗效果及作用机理，为临床治疗提供更科学、更确切的理论依据。
１ 实验材料
戊四唑，用前以生理盐水配制成质量浓度为２．５ ｍｇ／ｍＬ的溶液；平痫冲剂，用时煎煮浓缩；苯巴比妥，质量浓度为１．０３ ｍｇ／ｍＬ。
２ 实验方法
２．１ 动物分组
将６０只２８ ｄ龄的Ｗｉｓｔａｒ大鼠，质量 ｇ，雌雄各半，适应性饲养４ ｄ后，随机分为６组，分别为：正常对照组、模型组、西药治疗组、中药小剂量组、中药中剂量组、中药大剂量组。
２．２ 模型制备
除正常对照组外，其余５组均造模，方法参考徐国龙等［３］癫痫模型的制备，即用ＰＴＺ亚惊厥剂量３２ ｍｇ／ｋｇ，用前以生理盐水配制成质量浓度为２．５ ｍｇ／ｍＬ的溶液，腹腔注射，每日１次，持续４周后停药１周，再用相同剂量的ＰＴＺ测试。凡显示连续５次Ⅱ级以上惊厥的，则视为达到点燃标准，Ⅳ~Ⅵ级的痫性行为被视为充分点燃。大鼠惊厥发作采用７点评分法［３］。０级：没有行为上的发作；Ⅰ级：节律性点头或头部颤搐；Ⅱ级：阵挛性咀嚼；Ⅲ级：头部颤搐加前肢阵挛性抽搐；Ⅳ级：袋鼠姿势；Ⅴ级：跌倒；Ⅵ级：全身强直阵挛性惊厥。另外，正常对照组给予相同剂量的生理盐水。
２．３ 给药方法
造模成功１ ｄ后，除正常对照组和模型组外，其余各组开始灌服药物。平痫冲剂用时煎煮浓缩，灌胃剂量按人与大鼠体表面积比［４］，折算成大鼠等效剂量，每日按４ ｍＬ灌服平痫冲剂水溶液，质量浓度分别为低剂量组１．４ ｇ／ｍＬ、中剂量组３．３ ｇ／ｍＬ、高剂量组６．７ ｇ／ｍＬ，西药治疗组每日按 ４ ｍＬ灌服质量浓度为１．０３ ｍｇ／ｍＬ的苯巴比妥，正常对照组和模型组灌服等体积的生理盐水。每日灌胃１次，连续灌胃３周。
２．４ 灌注与取材
６组大鼠在相同条件下用乙醚吸入麻醉，四肢固定在手术板上，开胸，暴露心脏，直视下将穿刺针经左心室刺入，并以止血钳固定，然后剪开右心耳，随即用４ ℃预冷的生理盐水２５０ ｍＬ快速灌注，再灌注含４０ ｇ／Ｌ多聚甲醛的０．１ ｍｏｌ／Ｌ磷酸盐缓冲液５００ ｍＬ。先灌注再改为滴注，调节滴速，先快后慢，共滴注１ ｈ。观察大鼠全身僵硬后，迅速开颅取出完整大脑，去除脑干及小脑部分，将修整后的脑组织块置于上述滴注液内，４ ℃过夜，再置于２００ ｇ／Ｌ蔗糖中１２ ｈ。然后每个大脑半球于背侧海马最大断面处切取３ ｍｍ厚的组织，要求该组织必须含有大鼠颞叶组织。随后制成石蜡包块，再做冠状切片，厚度为４ μｍ。
　　２．５ 免疫组化染色
石蜡切片常规脱蜡，室温下放入Ｈ２Ｏ２稀释液中１０ ｍｉｎ后，滴加复合消化液８ ｍｉｎ，再滴加５ ％ＢＳＡ封闭液２０ ｍｉｎ，以１：１００的比例用蒸馏水将一抗稀释后，滴加在切片组织上，然后放在３７ ℃的培养箱中孵育１ ｈ［注：一抗有两种，一种是谷氨酸受体多克隆抗体；一种是γ－氨基丁酸受体多克隆抗体］，再滴加生物素化 山羊抗兔Ｉｇ Ｇ孵育２０ ｍｉｎ，滴加试剂ＳＡＢＣ孵育 ２０ ｍｉｎ后，ＤＡＢ显色，苏木素复染，盐酸酒精分化，自来水反蓝，梯度酒精脱水。再用中性树胶封片，晾干即可。
２．６ 图像分析及数据统计
对免疫组化反应切片进行图像分析。所有切片放大倍数均为１００，测量窗面积为１７１８１４ μｍ２。分别检测大鼠大脑颞叶皮质各层及齿状回的颗粒细胞层的免疫阳性反应细胞。每部位取两个视野，测量同一视野的阳性细胞数、阳性细胞积分吸光度、阳性细胞面积比，并分别取其平均数进行统计学分析。结果用ＳＰＳＳ １１．０统计软件进行统计学处理，作单因素方差分析，进行组间两两比较，实验数据以ｘ ± ｓ表示，以α ＝ ０．０５为显着性水准。
３ 结果
３．１ 谷氨酸受体
３．１．１ 平痫冲剂对戊四唑致痫大鼠大脑颞叶皮质ＮＭＤＡＲ１的免疫组化影响
见表１。
３．１．２ 平痫冲剂对戊四唑致痫大鼠大脑海马齿状回ＮＭＤＡＲ１的免疫组化影响
见表２。 Ｇｌｕ免疫阳性反应细胞广泛分布于大脑颞叶皮层及海马齿状回等部位。阳性细胞胞体呈锥体形、圆形、椭圆形，有１个或多个突起，有些突起有分支。同正常对照组比较，模型组的大脑颞叶皮质及齿状回ＮＭＤＡＲ１免疫阳性细胞数、阳性细胞面积比上升，积分吸光度增加，提示造模成功；与模型组比较，西药治疗组、中药小剂量组、中药中剂量组和中药大剂量组颞叶皮质及齿状回的ＮＭＤＡＲ１免疫阳性细胞数、阳性细胞面积比都有不同程度地下降，积分吸光度也有不同程度地减少，说明中药及西药治疗均能有效抑制ＮＭＤＡＲ１的表达，而中剂量平痫冲剂的抑制作用最强。
３．２ γ－氨基丁酸受体
３．２．１ 平痫冲剂对戊四唑致痫大鼠大脑颞叶皮质ＧＡＢＡＡＲα１的免疫组化影响
见表３。
ＧＡＢＡ免疫阳性反应神经元散在分布于大脑颞叶皮层及海马齿状回等部位。阳性细胞胞体呈圆形、卵圆形、三角形等，有的细胞有一至多个突起。同正常对照组比较，模型组的大脑颞叶皮质及齿状回ＧＡＢＡＡＲα１免疫阳性细胞数、阳性细胞面积比下降，积分吸光度降低；与模型组比较，西药治疗组、中药小剂量组、中药中剂量组和中药大剂量组颞叶皮质及齿状回的ＧＡＢＡＡＲα１免疫阳性细胞数、阳性细胞面积比都有不同程度地增加，积分吸光度也有不同程度地升高，说明中药及西药治疗均能有效促进ＧＡＢＡＡＲα１的表达，而其中平痫冲剂中剂量对ＧＡＢＡＡＲα１表达的促进作用最强。
４ 讨论
癫痫为儿科难治病之一，张士卿教授创立的平痫冲剂选取胆南星、僵蚕、天麻、代赭石、石菖蒲、丹参、白芍等为主要治疗药物，以化痰活血、熄风定痫为根本大法，临床疗效颇为显着。本课题选用戊四唑点燃致痫模型，被公认为是理想的癫痫动物模型，其致痫性增高具有永久的保留能力，并较好地模拟了人类癫痫的进行性发展和长期反复的自限性发作形式。其优点在于：制作方便，成功率高；不受麻醉剂和手术过程的影响，便于全面观察动物惊厥发作；所需仪器设备简单，容易推广；不破坏局部脑组织的结构，不伴有神经元损伤、坏死［５］。故有利于进一步开展脑组织各项指标的检测，尤其适用于癫痫脑组织形态学的观察。谷氨酸是中枢神经系统中最为丰富的兴奋性神经递质，而γ－氨基丁酸是脊椎动物中枢神经系统中分布最广泛的抑制性神经递质，研究认为它与所有中枢神经系统抑制过程的至少４０ ％有关。本课题选ＮＭＤＡＲ１和ＧＡＢＡＡＲα１为检测指标，是因其为兴奋性和抑制性氨基酸类神经递质受体的代表，是研究癫痫的传统指标。
【参考文献】
［１］汪受传．　中医儿科学［Ｍ］．　北京：中国中医药出版社，２００４：７ ．
［２］曾军，洪震，黄茂盛，等． 人群癫痫危险因素及社会心理因素病例对照研究［Ｊ］．中华流行病学杂志，２００３，２４：１１６－１１８ ．
［３］徐国龙，杨帆，章复清，等． 柴胡加龙骨牡蛎汤对ＰＴＺ点燃型癫痫大鼠脑内氨基酸含量的影响［Ｊ］．中国医药学报，２００２，１７：１６５－１６７ ．
［４］黄继汉，黄晓辉，陈志扬． 药理试验中动物间和动物与人体间的等效剂量换算［Ｊ］．中国临床药理学与治疗学［Ｊ］，２００４，９：１０６９－１０７２ ．
［５］李东培，才丽平，方秀斌． 哮喘豚鼠下呼吸道及内脏传入部位ＮＧＦ表达的研究［Ｊ］． 解剖学报，２００２，３３：３５０－3５４ ．