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棉花细胞质雄性不育研究进展

　　摘要棉花具有十分明显的杂种优势,棉花细胞质雄性不育在棉花杂种优势的利用上具有重要作用。利用棉花细胞质雄性不育和育性恢复系统突破传统人工去雄杂交育种的瓶颈,为棉花杂交种制种的商业化推广展现了光明的前景。综述了近年来棉花细胞质雄性不育在细胞学、生理生化、分子生物学和育性恢复4个方面的研究进展。详细阐明了棉花细胞质雄性不育小孢子败育时期及细胞学形态、生理生化指标研究、胞内基因组和核内恢复基因的分子生物学研究和获得理想恢复系的方法,并提出了研究中存在的主要问题,展望了今后工作的研究方向。
　　关键词棉花;细胞质雄性不育;育性恢复
　　AbstractThere is fully apparent heterosis in cotton. Cytoplasmic male sterility(CMS) has played an important role in heterosis usage in　and utilization of fertility restorer system have made a breakthrough in conquering breeding bottleneck by artificial emasculation and unfolded a bright outlook for promoting commercial production of hybrid seed. Research progress of four facials of cytology,physiological and biochemical indexes,molecular biology and fertility restoration on CMS in Gossypium hirsutum L. during the recent years were reviewed mainly in this paper. In the four facials which were reviewed mainly in this paper,period of microspore abortion and cytological morphology,physiological and biochemical indexes including carbohydrate,amino acid,enzyme and hormone,molecular biology of intracellular genome including chloroplast genome and mitochondrial genome and restoring gene in nucleus and methods of getting ideal and high resilience restorer on CMS in Gossypium hirsutum L. The objects of introducing all above these things in detail would tell peple current research status of the mechanism on CMS in Gossypium hirsutum L. and provide some helps for their relevant researches. The problems existing in the present study and the prospect to the future work on CMS in Gossypium hirsutum L. were proposed,which would provide references for related researchers.
　　Key wordscotton;cytoplasmic male sterility;fertility restoration
　　棉花是优质纤维、食用油和蛋白集一身的重要经济作物。如何提高棉花品种的产量、品质和抗逆性并使其广泛应用于生产是当前棉花育种亟需解决的问题。杂种优势的利用则为这一问题的解决提供了新的思路,并已在很多植物中得到了广泛的应用。棉花具有十分明显的杂种优势,但目前棉花杂种优势的利用则主要采用人工去雄授粉法和核不育系“一系两用”法,方法繁琐且制种成本高,难以大规模推广应用。而水稻、高粱等作物则主要采用细胞质雄性不育性(Cytoplasmic Male Sterility,CMS)实现“三系”配套来大面积利用杂种优势的,操作简便且制种成本低。尽管棉花CMS已实现“三系”配套,但由于其恢复源狭窄及不育胞质对杂种1代皮棉产量所产生的负效应,“三系”杂种棉选育进展缓慢。随着转谷胱甘肽S-转移酶基因(gst)强恢复系“浙大强恢”的育成以及海岛棉中育性增强基因的发现,利用“三系”配套进行棉花大面积的杂种优势利用成为可能[1]。笔者从细胞学、生理生化、分子生物学和育性恢复4个方面综述棉花CMS的研究进展,并对目前状况进行了展望。
　　1棉花CMS的细胞学研究
　　植物雄性不育小孢子的败育时期各异,从花粉母细胞(Pollen Mother Cells,PMCs)的形成到双核花粉粒各个时期都有雄性不育发生的可能,且持续时间比较长,不限于某一特定的时间。对于棉花CMS来说,小孢子败育时期的发生主要有3种情况:①主要集中发生于造孢细胞增殖时期。Murthi等对哈克尼西棉CMS进行细胞学研究的结果表明不育系的雄性败育大多数发生在造孢细胞增殖期,偶尔能形成PMCs,但在减数分裂的前期Ⅰ就退化,因此导致雄性不育。而Thomber等在美洲棉CMS系、黄晋玲等在晋A不育系也发现同样的败育情况。②主要集中发生于减数分裂时期。如王学德等发现104-7A、湘远4-A、NM-2A和NM-3A的小孢子母细胞在造孢细胞增殖时期较少异常,但在减数分裂时期特别是减数分裂第1次分裂时期(Meiosis Ⅰ)却大量败育,从而在花药内见不到四分体的形成。③败育时期贯穿造孢细胞增殖至减数分裂时期。童旭宏等发现来源于陆地棉新型CMS的败育时期主要发生在造孢细胞增殖时期至小孢子母细胞减数分裂前的时期。
　　目前国内外大多数学者认为棉花胞质不育系花药绒毡层的过早退化或推迟解体与造孢细胞和PMCs的败育密切相关。通过细胞学观察,棉花CMS小孢子败育过程中主要出现的细胞形态特征为:①造孢组织异常。如哈克尼西棉CMS系的造孢组织在发育成熟前就已解体。②细胞质和线粒体异常。如晋A不育系的大量小孢子母细胞在造孢细胞增殖期,细胞质大量液泡化,留下网状残体;线粒体处于解体状态,线粒体膜和内部结构模糊,基质呈半透明甚至透明状态,内嵴紊乱。③细胞核异常。如NM 21A的小孢子母细胞在减数分裂期,核仁穿壁频繁,出现2~3个微核多核细胞。④细胞形状异常。小孢子母细胞呈半月形和网状形,且连成巨型团块。⑤染色体异常。在中期Ⅰ出现落后染色体单体,在后期I染色体不是集中于两极,而是凝结成若干个大小不一的团块散布于两极。⑥绒毡层过早退化或推迟解体。如晋A不育系的绒毡层细胞在造孢细胞增殖期就过早退化。

　　2棉花CMS的生理生化研究
　　正常的生理生化代谢是植物生长发育所需能量的基础,而研究育性表达过程中的生理生化代谢对雄性不育的生化机理探讨具有重要的意义。目前已有许多学者对棉花CMS的一些生理生化指标进行了大量的研究,取得了显着成果。在碳水化合物方面,王学德通过对中棉所12A及其保持系中棉所12B的花药进行研究发现,从造孢细胞增殖期开始,保持系可育花药随着发育可溶性糖含量逐渐下降,淀粉积累逐渐增多,特别在PMCs减数分裂后,小孢子发育至花粉成熟过程中有大量淀粉合成;相反,不育花药中的淀粉和可溶性糖含量,从造孢细胞增殖时期起一直处于原来水平几乎不变。可见,缺乏淀粉积累是引起花药不育的重要原因。在氨基酸方面,Servella等首次报道了亚洲棉CMS花药中酸性氨基酸含量较低;在氨基酸组分中,不育系叶片中天门冬氨酸和精氨酸含量较高,而保持系叶片中含量很少或完全缺失。随后王学德等也在棉花不同CMS研究中发现了同样的情况。这说明氨基酸含量异常导致蛋白质合成受阻,从而引起花药不育。在酶方面,黄晋玲等[10]研究发现晋A不育系及其保持系的过氧化物酶同工酶和细胞色素氧化酶同工酶存在明显的差异,这种差异产生的时期与其细胞形态学观察到的小孢子败育时期一致。这说明雄性不育基因调控了同工酶的形成与差异。在激素方面,解海岩等[11]用酶联免疫检测技术对哈克尼西棉CMS、保持系、恢复系和杂种F1在花药发育时期内源激素含量的动态变化进行研究,发现在保持系、恢复系和F1的可育花药之间内源激素差异不明显,但在可育花药与不育系的不育花药间差异显着。在活性氧代谢方面,Jiang等[12]通过对哈克尼西棉CMS、保持系和杂种F1不同发育时期的花药进行活性氧指标及其清除酶含量研究发现,在不育系败育初期的花药中,超氧阴离子(O2-·)、过氧化氢(H2O2)、丙二醛(MDA)3个对细胞有毒性的活性氧指标均高于保持系或杂种F1的花药,同时对活性氧具有清除作用的超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和过氧化物酶(POD)3个抗氧化酶活性也随着提高,表明败育初期花药的活性氧增加对抗氧化酶有诱导作用。但在败育盛期的不育花药中,一方面O2-·、H2O2和MDA含量极显着高,另一方面SOD、CAT、POD 酶活性却极显着低,导致活性氧产生与清除失去平衡,这时花粉母细胞大量凋亡。在败育后的花药中,O2-和H2O2含量与可育花药相近,但MDA含量仍持续提高,以及SOD、CAT、POD酶活性持续降低,表明雄性细胞凋亡后活性氧对花药仍有不利影响。花药O2-、H2O2和MDA的过量积累,及其清除酶活性的显着降低,这一过程在棉花不育花药中是与雄性细胞凋亡同步发生的,但在恢复基因引入后的杂种F1花药中,过量产生的活性氧可被清除。这表明棉花CMS与花药活性氧代谢异常密切相关。
　　3棉花CMS的分子生物学研究
　　棉花CMS是一种母性遗传性状,受特定的细胞质基因和核内不育基因共同控制,不育系的细胞质基因组如线粒体基因组、叶绿体基因组与不育花粉的形成密切相关[1]。在线粒体基因组方面,线粒体功能的行使是由核基因组和线粒体基因组共同作用的。Christine[13]认为目前至少有14个线粒体基因与细胞质不育有关,且共有特征是基因的开放阅读框由来源于线粒体基因的编码序列、基因的侧翼序列和未知区域的序列共同组成。线粒体基因组的重排、突变及线粒体基因的剪切、编辑都可能引起细胞质雄性不育。2003年,黄晋玲[14]用合成的线粒体基因组探针(atpA、atp6、atp9、coxⅠ、coxⅡ和cob)对晋A胞质不育系和保持系线粒体DNA(mtDNA)进行了限制性片段长度多态性(restricted fragment length polymorphisms,RFLP)分析,发现atp6和coxⅡ基因在两者中的杂交带型不一致;与保持系相比,atp6和coxⅡ基因在晋A不育系中分别缺少 kb和 kb的强杂交带,并推测条带的缺失可能是mtDNA分子内或分子间重排所致,coxⅡ基因的变异导致了线粒体功能的失调和雄性不育。随后她构建了棉花晋A不育系和保持系的线粒体文库,获得了晋A不育系和保持系的orfB、coxⅠ和nad4L等3个基因的全序列,通过比较,证明晋A不育系和保持系在orfB、coxⅠ和nad4L基因全序列上无差异。此外,也有人认为棉花CMS可能是由线粒体基因组中新的嵌合阅读框编码一种毒蛋白质,该蛋白质干扰保守基因的生物活性或者干扰花药发育的生理生化过程,从而中断花粉发育[15]。在叶绿体基因组方面,叶绿体基因的变异与棉花胞质不育有关。Chen等[16]研究认为,棉花CMS与叶绿体RubisCO大亚基的变异有关。Galau等[17]证实,不育系与保持系之间在叶绿体DNA的限制性酶切片段长度上存在明显差异。在核内基因方面,目前国内外主要集中在与棉花育性恢复基因相连锁分子标记开发及遗传图谱的精细定位、育性恢复相关基因的分离克隆等方面并已取得明显进展。Wang等[18]利用RAPD、AFLP、STS、CAPS和SSR标记技术分析了(D8×SG747)×SG747群体,发现了3个新的RAPD标记和1个SSR标记,利用PPR基序设计的保守引物与AFLP组合测试回交群体得到一个与恢复基因Rf2连锁的PPR-AFLP标记,并结合9个与Rf2紧密连锁的分子标记构建了与Rf2紧密连锁的遗传图谱,由于CIR179250与Rf2和Rf1都紧密连锁,推测Rf2和Rf1都定位与D亚染色体组的LGD08连锁群上。Zhang等[19]通过差异展示技术鉴定分离了不携带恢复基因可育的保持系ARK8518(rf2rf2)和含有D8胞质近等基因系杂合体恢复系ARK8518(rf2rf2)在花药组织中的差异表达基因。并首次在棉花上阐释了CMS和其恢复系的分子机制,特别是淀粉合成酶和PAT基因可能与CMS-D8中的Rf2基因相关。
　　4棉花CMS的育性恢复
　　尽管棉花CMS已经实现“三系”配套,但“三系”杂种棉选育进展缓慢。可见,棉花CMS的育性恢复是实现棉花杂种优势利用的关键。目前获得恢复系的方法主要有:①通过远缘杂交及回交等手段来获得好的恢复系。如Sheetz等[20]以恢复系DES-HAF277为母本,与海岛棉品种PimaS-4杂交,聚合恢复基因Rf和育性增强基因E,育成带有育性增强基因E的恢复系。②利用转基因等生物工程技术来获得好的恢复系。如王学德等[21]采用农杆菌介导法,将谷胱甘肽S-转移酶基因(gst)导入恢复系DES-HAF277中,育成一个对CMS具有强恢复力的恢复系“浙大强恢”。③以与胞质雄性不育系具相同遗传背景的可育种质为原始材料,利用遗传过滤技术培育出胞质雄性不育恢复系。这个方法是范万发等[22]在成功培育出理想的、使Wnafstu胞质不育系和其的F1代完全恢复育性的胞质雄性不育恢复系的过程中积累资料的基础上提出来的。
　　5 结语
　　综上所述,棉花CMS在细胞学、生理生化、分子生物学和育性恢复方面取得了一定的成果,但仍存在着一些问题。如线粒体、叶绿体基因组和核内基因如何影响花粉的发育,恢复基因与不育基因的作用机理及其克隆都还需进一步研究。随着分子生物学理论和技术的发展,特别是棉花基因组全测序计划的启动,在不久的将来必将会克隆出许多与棉花CMS相关基因,从而为棉花CMS的研究打开新的局面。

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