正交实验法筛选千斤拔多糖的提取分离工艺.docx

正交实验法筛选千斤拔多糖的提取分离工艺
【摘要】 　　目的研究千斤拔多糖的提取分离的最佳工艺条件。方法采用正交设计法筛选。结果千斤拔多糖的最佳提取分离工艺为：采用加热回流法，石油醚回流3 h；滤渣用乙醚回流5 h；滤渣用95 % 乙醇回流5 h，滤渣用18倍量提取3次，2 h/次，提取液浓缩至10 ml，加入乙醇后使溶液中乙醇的浓度约为90% ，静置8 h后抽滤，真空干燥即得千斤拔多糖粗品。结论该实验为千斤拔多糖的提取分离的条件提供了参考，为千斤拔的进一步开发研究提供了依据。
【关键词】 千斤拔 多糖 提取分离工艺 正交设计
　　常见妇科疾病以经前期综合征、阴道炎症、乳腺增生三大疾病最为明显，其中阴道炎症为常见和多发妇科疾病，严重影响患者的生活质量。目前市面上治疗效果和销量较好的妇科千金片对阴道炎症有良好的治疗作用，为女性妇科炎症首选药物。千斤拔为其君药。《中国药典》2005版Ⅰ部中收载千斤拔为豆科植物蔓性千斤拔Moghania philippinensis(Merr. et Rolfe)Li.、大叶千斤拔Moghania macrophylla(Willd.)或绣毛千斤拔Moghania ferruginea( Benth.)Li.的干燥根［1］，用于治疗风湿痹痛、腰腿痛、风湿关节炎、腰肌劳损、阳痿、遗精、妇科病、乳房疾病等病症［2］。蔓性千斤拔、大叶千斤拔分布较广，主产于江西、福建、台湾、湖北、湖南、广西、广东、四川等省区 ［3］。文献报道千斤拔含有多糖、黄酮、生物碱、β-谷甾醇等多种成分［2］。多糖是一类天然大分子物质, 多糖参与了细胞各种生命活动的调节。大量的药理和临床研究表明植物多糖类化合物是一种免疫调节剂, 它具有激活免疫细胞、改善机体免疫功能等作用［4］。《中国药典》尚未收载千斤拔的质量标准，目前未见有关千斤拔多糖成分的研究报道。本文分别考察了不同提取方法、不同浓度、时间、物料比条件下提取千斤拔多糖的工艺，以期为安全、可控、有效地利用该药材和新药开发研究打下坚实的科学基础。
　　1 材料与仪器

　　UV-752分光光度计(上海第三分析仪器厂)；SHB-3循环多用真空泵；旋转蒸发仪；hh-2数显恒温水浴锅；hctp11b5托盘天平；正德牌远红外可控调温电炉；DHG-9240A型电热恒温鼓风干燥箱；KQ-250B型超声波清洗器。(+)葡萄糖(AR，105 ℃干燥至恒重)；其他试剂均为分析纯。千斤拔药材购于成都药材市场，经刘圆博士鉴定为蔓性千斤拔Moghania philippinensis(Merr. et Rolfe)Li.的根。苯酚试剂［5］: 取苯酚150 g，加铝片 g和碳酸氢钠 g，蒸馏，收集182 ℃馏份。称取10 g，加水200 ml溶解，置棕色瓶内放冰箱中备用。
　　2 方法

　　以改良苯酚-硫酸法［5］ 测定千斤拔多糖的含量。
　　线性关系考察
　　葡萄糖标准溶液的制备精密称取干燥至恒重的葡萄糖标准品70 mg，用水稀释成为700 μg·ml-1的对照品溶液。分别精密吸取对照品溶液 ，， ，， ， ， ml置50 ml容量瓶中，用水稀释至刻度，再精密吸取 ml于具塞试管中。各管精密加入 %苯酚溶液［3］ ml，摇匀，迅速分别滴加浓硫酸 ml，摇匀后放置5 min，置沸水浴中加热15 min，取出冷至室温后，于490 nm处测定吸光度值。以浓度C(μg·ml-1)为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线，得回归方程：A= 6　8,r = 6 (n=6)。结果表明，在～ μg·ml-1之间，葡萄糖浓度与吸收度值具有良好的线性关系。
　　粗多糖样品溶液的制备精密吸取定容后的粗多糖溶液20 ml置100 ml容量瓶中，稀释至刻度，精密吸取2 ml显色，备用。
　　精密度实验取同一样品溶液，重复测定吸光度6次，RSD为 %。结果表明方法精密度良好。
　　稳定性实验取样品溶液，每隔 h测定吸光度值，连续4 h，RSD为 %。结果表明样品稳定性良好。
　　加样回收实验精密称取已知多糖含量的粗多糖溶液1 ml，3份，依次加入不同量的葡萄糖对照品溶液，取“”项下的对照品溶液，按“”项下测吸光度供试品溶液的制备方法，自“各管精密加入 %苯酚溶液 ml”起，依法操作，测得样品吸光度值，根据标准曲线求多糖的含量，并以葡萄糖标准溶液作对比测定，计算多糖回收率为 %，RSD为%。
　　提取物中多糖含量测定精密吸取定容后的粗多糖溶液20 ml置100 ml容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，精密量取 ml置10 ml具塞试管中，按“”项下测吸光度供试品溶液的制备方法，自“各管精密加入 %苯酚溶液 ml”起，依法操作，测得样品吸光度值，根据标准曲线求多糖的含量。粗多糖得率(% )=沉淀重量×多糖含量÷称样量×100% 。
　　3 结果
　　单因素考察
　　考察石油醚、乙醚、乙醇脱脂的必要性取千斤拔干燥粉末7份，精密称定，一份直接用水回流提取；一份用石油醚回流6 h。滤过，取滤渣，挥去溶剂后用水回流提取；一份用石油醚提取，药渣挥去溶剂后用乙醚回流提取6 h，药渣挥去乙醚后用水回流提取；一份直接用乙醚直接回流提取6 h，药渣挥去乙醚后用水回流提取；一份用石油醚提取，药渣挥去溶剂后用乙醚回流提取6 h，药渣挥去乙醚，再用95 %乙醇回流6 h，药渣挥去乙醚后用水回流提取；一份直接用95 %乙醇直接回流提取6 h，药渣挥去透剂后用水回流提取；一份用石油醚提取，药渣挥去溶剂后用95 %乙醇回流提取6 h，药渣挥去溶剂后用水回流提取。结果显示用石油醚、乙醚、95%乙醇都回流提取后，脱脂效果最好。
　　考察石油醚、乙醚、95 %乙醇回流时间分别逐步考察千斤拔药材分别经石油醚、乙醚、95 乙醇回流2 ，3 ，4 ，5 ，6 ，7 h后，滤过，溶液在200～400 nm进行全波长扫描。确定其最佳回流时间。结果表明，石油醚的最佳提取时间为3 h；乙醚的最佳提取时间为5 h；95%乙醇的最佳提取时间为5 h。
　　考察不同的提取温度对千斤拔多糖粗品提取量的影响 称取千斤拔干燥粉末约5 g ，5 份，精密称定，各精密加入100 ml石油醚，分别回流3 h，过滤，药渣挥去石油醚，分别精密加入100 ml乙醚，分别回流5 h，过滤，药渣挥去乙醚，分别精密加入95 %乙醇100 ml，分别回流5 h，过滤，挥干药渣 ，分别于药渣中加入100 ml水，一份直接加热使沸腾回流2 h，另4份滤渣分别用60，50，80 ，90 ℃ 的水温浸2 h。滤过后，滤液定容至500 ml，按“”项下方法测定。结果表明，沸水回流者所提出的粗多糖最多，故选用沸水回流提取千斤拔多糖。
　　考察不同药材粉碎度对千斤拔多糖粗品提取量的影响称千斤拔干燥粉末取过24目、打碎不过筛、饮片的药材各约5 g，精密称定。按“”项下各精密加入100 ml石油醚回流3 h起，选用沸水回流，其余步骤依法操作。结果表明，过24 目的粉末所提出的粗多糖最多。
　　考察不同脱色方法对千斤拔多糖粗品性状的影响称取千斤拔茎皮粉末约10 g，3 份，精密称定，按照“”项下方法自“精密加入石油醚100 ml”起，相同操作至合并滤液3 份滤液，第1份室温加入3 %的双氧水溶液使滤液双氧水浓度至 %，并用碳酸氢钠溶液调节pH值至9～10；第2份加活性炭加热回流，滤去活性炭；第3份不脱色，作为空白对照，之后浓缩，再加95 %乙醇，使溶液乙醇浓度达到80 %。置冰箱冷藏室内放置过夜，过滤，沉淀分别用无水乙醇、丙酮、乙醚脱水后置真空干燥箱内干燥，观察得到的千斤拔多糖粗品的性状。结果表明，用双氧水脱色效果最好。
　　正交实验设计
　　提取过程的正交实验设计选用L9正交表进行正交实验设计，因素水平通过预实验选取安排见表1，正交实验及结果见表2。称取千斤拔药材约5 g，9份，分别各精密加入100 ml石油醚，分别回流3 h，过滤弃去滤液，药渣挥去石油醚，分别精密加入100 ml乙醚，分别回流5 h，过滤，弃去滤液，药渣挥去乙醚，分别精密加入95 %乙醇100 ml，分别回流5 h，过滤，弃去滤液，挥干药渣 ，滤渣按正交设计分别进行水提取。提取液定容到500 ml，精密量取20 ml定容到100 ml，再精密量取 ml，按“”项下自“各管精密加入 %苯酚溶液 ml”起，依法操作，测定吸收度。
　　表1 提取工艺因素水平
　　表2 提取工艺正交实验结果
　　对正交实验进行方差分析的结果见表3。
　　表3 千斤拔多糖提取工艺的方差分析结果
　　正交实验的结果表明，I2A＞I3A＞I1A；I1B＞I3B＞I2B； I3C＞I2C＞I1C，因此A，B，C三因素的最优势水平是A2，B1，C3 。A，C两个因素的P值皆＜，故都为主要因素，而B的P值＞，故为非主要因素。因此，最佳实验方案为A2B1C3，即提取3次，2 h/次，加水量18倍。

　　为考察上述实验方案的稳定性，按该最佳工艺提取3批产品，分别测定总多糖的得率。计算得多糖的平均得率为(±)% 。3次结果差异较小，说明该工艺稳定可行。
　　沉淀过程的正交实验设计选用L9正交表进行正交实验设计，因素水平安排见表4,正交实验及结果见表5。在按此实验所得最佳提取方法提取，所得溶液浓缩后加入乙醇并静置，滤过，挥去溶剂，恒重后精密称量所得粗多糖。
　　表4 沉淀因素水平
　　表5 L9(3)4 沉淀条件正交实验结果
　　对以上结果进行方差分析的结果见表6。

　　正交实验的结果表明：I3A＞I2A＞I1A；I1B＞I3B＞I2B； I1C＞I2C＞I3C，因此A、B、C三因素的最优势水平是A3，B1，C1 ，A、C三因素的P值皆＜，故都为重要因素，B因素的P值＞，为非重要因素。

　　因此，最佳实验方案为A3B1C1，即加醇使醇浓度达到90 %，静置8 h，提取液浓缩到10 ml。为考察上述实验方案的稳定性，按该最佳工艺提取3批产品，分别测定总多糖的得率。计算得多糖的平均得率为(±)% 。3次结果差异较小，说明该工艺稳定可行。
　　表6 千斤拔多糖方差分析结果
　　验证实验以上实验得出千斤拔多糖的最佳提取工艺为：石油醚回流3 h；滤渣用乙醚回流5 h；滤渣用95 % 乙醇回流5 h，滤渣用18倍量提取3次，2 h/次，提取液浓缩至10 ml，加入乙醇后使溶液中乙醇的浓度约为90% ，静置8 h后抽滤，真空干燥即得粗多糖。为考察上述提取工艺的稳定性，按该最佳工艺提取3批产品，分别测定总多糖的得率。计算得多糖的平均得率为(±)% 。3次结果差异较小，说明该工艺稳定可行。
　　4 讨论

　　植物多糖提取时用酸浸提法和碱浸提法很容易使部分多糖发生水解，从而破坏多糖的活性结构，所以千斤拔多糖用水反复提比较适宜。

　　由于粗多糖接触空气颜色易氧化变深，在过滤过程中分别用石油醚、乙醚、乙醇对粗多糖沉淀依次洗涤，消除了这种变化，而后置真空干燥箱内干燥即可得浅棕黄色的粗多糖。

　　千斤拔中多糖含量较高，但对于其多糖的药理研究比较少。

　　本实验采用正交法优化了千斤拔多糖的提取工艺，该工艺具有稳定、准确、操作简单、生产成本较低的优点，为千斤拔的进一步开发打下了良好基础。
【参考文献】
　　［1］ 国家药典委员会.中国药典，2005版Ⅰ部［S］.北京：化学工业出版社，2005：2.
　　［2］ 宋立人，洪 恂，丁续亮，等．中国中药学大辞典(上)［M］．北京:人民卫生出版社，2001:195.
　　［3］ 饶伟文, 黄建楷,温志芳，等.千斤拔的品种调查与质量研究［J］.中草药，1999，30：219.
　　［4］ 王道福.中药多糖免疫调节作用的研究进展［J］.实用医药杂志，2007，24：235.
　　［5］ 董 群，郑丽伊，方积年.改良苯酚－硫酸法测定多糖和寡糖的含量［J］.中国药学杂志，1996，31：550.