遗传学实验5-小鼠骨髓细胞染色体标本的制备和观察.pdf

遗传学实验 五 小鼠骨髓细胞染色体标本的制备和观察 生 96 华以超 2009030049 1 遗传学实验遗传学实验 五五 小鼠骨髓细胞染色体标本的制备和观察小鼠骨髓细胞染色体标本的制备和观察 生 96 华以超 2009030049 实验日期：2010 年 11 月 15 日 同组姓名：王婧 一、实验目的实验目的 了解动物骨髓细胞染色体制片的一般方法（细胞收集、低渗、滴片等）；观察和了解小鼠染色体的数目及形态特征。二、实验原理实验原理 进行染色体标本的制备一般取自细胞分裂旺盛的组织，如骨髓、淋巴细胞等；将秋水仙素注射到动物的腹腔内，经肠系膜吸收并可转运到骨髓，使正在分裂的细胞不能形成纺锤体，使得染色体停在中期状态，经过处理和制片后就可以清楚地观察到染色体。三、实验用具和材料实验用具和材料 解剖盘、解剖刀、剪、注射器、离心机，等；体重在 20g 左右的小鼠；低渗液（0.075M KCl）、固定液（甲醇与醋酸二者体积比为 3:1，不同于 Carnoy I 固定液）、4.0g/L秋水仙素溶液、改良苯酚品红染液。四、实验过程和步骤实验过程和步骤 1 注射注射：向小鼠腹腔注射秋水仙素溶液（用量 10-30g/g 体重），处理时间为 2-3h；2 取材取材：在解剖盘上用断颈法迅速将小鼠处死，然后将其两支股骨取出，用解剖剪将附着在股骨上的肉剥离干净（注意正确寻找股骨注意正确寻找股骨）。用解剖剪将股骨头的两端剪开，暴露出骨髓腔。用注射器吸取已经提前在 37下温育的低渗液共 2 mL，将针头插入骨髓腔中冲洗骨髓，使冲洗液从另一端流出。将两根股骨的冲洗液汇集到同一个5 mL刻度离心管内，使冲洗液达到4 mL；3 低渗低渗：用吸管将冲洗液吹打几次，然后把离心管放在 37 的恒温水浴锅中低渗 20 min；4 固定固定：向离心管中加入 1 mL 固定液，吹打均匀后 37固定 10 min 后 1500 r/min 离心 10 min；5 再固定再固定：加入 5mL 固定液，其余同步骤 4；6 制备细胞悬液制备细胞悬液：弃去上清液，留大约与沉淀等量的上清液，用吸管吹打成细胞悬液；7 滴片滴片：从冰箱或冰盒内取出 4 张放在乙醇中预冷的载玻片，迅速迅速擦干并排摆好。将细胞悬液吸入吸管内，手持吸管在载玻片上方向下滴片。理论上滴管越高越好，但一定注意假如距离但一定注意假如距离在在 1m 以上，滴管口以上，滴管口一定要一定要没有缺口！否则竖直向下滴片时，悬液不是数值降落而是成抛没有缺口！否则竖直向下滴片时，悬液不是数值降落而是成抛遗传学实验 五 小鼠骨髓细胞染色体标本的制备和观察 生 96 华以超 2009030049 2 物线下降物线下降以致滴出载玻片范围以致滴出载玻片范围！8 染色染色：自然干燥自然干燥后（可以适当扇一扇加快速度）在载玻片正面用记号笔作一标记，并在有细胞悬液痕迹的位置上滴加改良苯酚品红染液染色 10-15min；9 去浮色、镜检、显微拍照、整理仪器去浮色、镜检、显微拍照、整理仪器。五、实验结果实验结果 小鼠骨髓细胞染色体小鼠骨髓细胞染色体（图（图 1、2）（拍摄：王婧）（拍摄：王婧）：图图 1 小鼠骨髓细胞染色体（小鼠骨髓细胞染色体（10*100）图图 2 小鼠骨髓细胞染色体（小鼠骨髓细胞染色体（10*100）可以看到如上两幅照片内染色体基本分散开，但仍不是非常理想；再结合分辨率等原因，辨认出全部染色体可能有一定困难。经过多次仔细地计数，可以分辨的染色体条数为 34-38 之间，与理论值共 40 条有一定差距（图 3）。遗传学实验 五 小鼠骨髓细胞染色体标本的制备和观察 生 96 华以超 2009030049 3 图图 3 小鼠（小鼠（Mus musculus）染色体示意图）染色体示意图 六、作业及思考题作业及思考题 1 统计小鼠统计小鼠 2n 染色体的数目，仔细观察其形态特征。染色体的数目，仔细观察其形态特征。可分辨的染色体数目在 34-38 条之间，其中与理论值相差几条的原因可能在于有部分染色体有重叠。染色体的形态上多为中部着丝粒染色体。2 低渗液起到什么作用，在使用过程中应注意什么问题？低渗液起到什么作用，在使用过程中应注意什么问题？低渗液使细胞处于膨胀状态而不至于破裂，利于染色体分散，这为后面完成滴片时细胞膜及核膜的破裂做好准备，便于制成分散较好的染色体。用时要注意浓度及处理时间，渗透压太低或时间太长会使细胞直接吸水涨破，细胞内染色体扩散导致观察时出现遗失；反之滴片时容易分散不开。七、实验心得与体会实验心得与体会 1 股骨的判定股骨的判定 将小鼠的整条腿卸下，进行弯折，会感觉到整条腿大约分成三节，从下至上依次对应人的脚掌（较长）、小腿、大腿（较短），因此小鼠的股骨对应大腿部位而不应把较长的胫骨（对应小腿）错当成股骨。2 关于滴片关于滴片 老师的建议是将 4 张载玻片并排置于地上，然后手持滴管（高过头顶）向下滴细胞悬液，这样滴管口离载玻片约两米高，照这样做的同学得到的结果效果一般比较理想。实验时还见到有的同学站在实验台上向下滴，想必滴到载玻片上打散染色体的效果一定很好。但前提是：细细胞悬液得滴到载玻片上胞悬液得滴到载玻片上！一开始我也打算距离两米向下滴，但想了想不能保证一定能滴到载玻片上，于是斟酌再三决定从低处（大约 1m 左右）逐渐升高，以使保证至少能滴在载玻片上。幸亏当时有这样一个念头可谓“救了我们一命”，否则一味追求高度的话怎么死的都不知道之前我对准载玻片滴了几滴，王婧同学在下面盯着看我滴到哪里，结果我滴完以后她告诉我根本就没看见我滴在哪儿！本来细胞悬液就不多，当时滴管里更是没剩下多少，我于是自己将滴管升高又滴了两滴，这时才发现尽管我滴管口是正对着载玻片，但液滴滴下的瞬间却不是竖直降落而是成抛物遗传学实验 五 小鼠骨髓细胞染色体标本的制备和观察 生 96 华以超 2009030049 4 线下降！此时仔细观察滴管口，才发现上面有个缺口！此时仔细观察滴管口，才发现上面有个缺口！虽然事后证明我们的确有悬液滴到载玻片上（否则也做不出结果），但估计可能也就是前几滴滴在载玻片上，后面抬高滴管后肯定是都滴在外面了。虽然效果不如别的组那么好，但至少也算是有结果了吧。故，在此我以“血的教训”来劝诫以后要做该实验的同学，也希望老师在此我以“血的教训”来劝诫以后要做该实验的同学，也希望老师能够在以后上课时提醒大家一下：能够在以后上课时提醒大家一下：如果想要得到理想的结果而决定加大高度滴片的话，一定先如果想要得到理想的结果而决定加大高度滴片的话，一定先检查滴管口是否有缺检查滴管口是否有缺口！口！此外，此外，建议在滴片时，在载玻片下方垫一些建议在滴片时，在载玻片下方垫一些干干的报纸，这样即便滴片的报纸，这样即便滴片滴出载玻片范围也可以及时发现，以便于及时调整！滴出载玻片范围也可以及时发现，以便于及时调整！3 做标记做标记 这是老师第一节课就提醒到的问题，是为了防止因载玻片防反导致在显微镜考试中调不出清晰的图像。尽管这是小概率事件，但我却真的没想到能亲眼目睹这一悲剧在某些同学身上发生！因此，在此建议以后做该实验的同学，要考试以前一定在脑子里蹦上这一根弦，不要大风大浪都过去了，却在这样的小阴沟里翻船 这是本学期最后一节必做实验课。最后，真心感谢老师和助教一学期以来对最后，真心感谢老师和助教一学期以来对我的指点与帮助，感谢您们陪我度过了一段充实而又难忘的时光！我的指点与帮助，感谢您们陪我度过了一段充实而又难忘的时光！八、参考资料参考资料 张贵友、吴琼、林琳等，普通遗传学实验指导，清华大学出版社，2003 年 1 月。2010/11/24