乳腺癌组织中微淋巴管分布及密度的临床病理意义.docx

乳腺癌组织中微淋巴管分布及密度的临床病理意义
【摘要】 目的 探讨乳腺癌组织中微淋巴管分布、密度及其与相关临床病理因素之间的关系, 分析乳腺癌淋巴结转移的可能机制。方法 应用免疫组化SABC法检测50例乳腺癌及其相应癌旁正常乳腺组织中D2-40的表达，并分别计数其微淋巴管密度。结果 乳腺癌组织中的MLD明显高于癌旁正常组织()，且肿瘤不同区域中MLD有所差异，肿瘤边缘区MLD均值显着高于癌旁正常组织及肿瘤中心区均值()；肿瘤中心区MLD与正常组织MLD无显着性差异()；肿瘤边缘区MLD与乳腺癌的临床分期、淋巴结转移状态相关()，与年龄、肿瘤大小、组织分型及雌、孕激素受体状态无关()。结论 1)乳腺癌组织中存在淋巴管，且分布存在异质性，淋巴管主要分布于肿瘤边缘区，肿瘤边缘区MLD与淋巴结转移、临床分期状态相关，其MLD的增加可能与乳腺癌的侵袭及转移相关；2)乳腺癌组织中的MLD检测可作为评估乳腺癌淋巴结转移状况的一项辅助指标，为判断乳腺癌患者预后及确定临床治疗方案提供实验和理论依据。
【关键词】 乳腺癌 D2-40 MLD 淋巴结转移 免疫组织化学
Abstract Objective To investigate the characteristics of distribution and density of lymphatic vessel and the correlation with its clinicopathological factors in breast cancer and analyse the possible mechanism of lymph node metastasis in breast carcinoma. Methods Making use of immunohistochemistry to research the expression of D2-40 in 50 cases of breast carcinoma and the normal tissues near the tumor borderline,which microlymphatic density was counted. Results The MLD in breast carcinoma was significant higher than that in the normal tissue adjacent carcinoma() and it was not the same in different aeras of carcinoma .The MLD in tumor borderline was higher than that in the normal tissues and tumor center tissues ()and There was no correlation in the tumor center and the normal tissue (). The MLD in the borderline had positive relation to the clinical stage, and lymph node metastasis (), but it had no significant difference from age,tumor diameter,histologic types , progestoger and estrogen receptor condition (). Conclusions 1. The lymphatic vessel appears in the breast carcinoma. It mainly distributes in the tumor borderline. The MLD in the tumor borderline has correlation with clinical stage ,lymph node metastasis. The increase of MLD may be related to the invasion and metastasis of breast carcinoma in the tumor　The detection of MLD in the tissue of breast carcinoma can be a important affiliated markers to evaluate the lymph node metastasis. It also can measure the prognosis of breast carcinoma and provide experimental and theoretical foundation to confirm the clinical treatment methods
Key words Breast carcinoma D2-40 Microlymphatic density Lymph node metastasis Immunohistochemistry
肿瘤细胞经淋巴道转移是人体上皮源性恶性肿瘤的早期扩散主要途径之一。但由于缺乏淋巴管特异性标记物，对肿瘤淋巴管转移的研究相对滞后。肿瘤内是否存在淋巴管，肿瘤内淋巴管生成是否与淋巴道扩散转移有关？目前对此存在争议［1,2］。乳腺癌局部淋巴结转移十分常见，是影响预后的关键因素之一，一旦出现淋巴结转移，其患者生存率明显降低。为此本实验选取50例乳腺癌及其相应癌旁正常乳腺组织标本，应用免疫组化SABC法采用新近发现的淋巴管特异性标记物D2-40抗体，对乳腺癌和癌旁正常乳腺组织淋巴管进行染色标记，并计数其微淋巴管密度，以此来探讨乳腺癌组织中的MLD特点及其与乳腺癌相关病理因素间的关系，并探讨MLD与淋巴结转移的关系和可能的机制，为乳腺癌的临床治疗及预后判断提供一定的理论依据。
1 材料与方法
　标本
收集青海大学附属医院病理科2004年11月～2005年10月手术切除的乳腺癌及相应癌旁正常组织石蜡包埋标本50例。患者均为女性病例，年龄33～72岁，平均54．5岁，其中50岁者27例，≥50岁者23例；根据2003年WHO制定的乳腺癌病理学分类标准进行病理组织学分类和TNM分期：浸润型导管癌35例，导管内癌13例，小叶原位癌2例；肿瘤≤2 cm者24例，2 cm者26例；伴有淋巴结转移者27例，无淋巴结转移者23例；Ⅰ～Ⅱ期者28例，Ⅲ～Ⅳ期者22例。所有病例术前均未接受放疗和化疗。所有标本经10％福尔马林液固定后制成切片，切片贴于多聚赖氨酸处理过的玻片上。每个蜡块切片5张，然后行常规HE染色及免疫组织化学SABC法染色。
　试剂
即用型鼠抗人D2-40单克隆抗体(产品编号为ZM-0465)购自北京中杉金桥生物工程有限公司。即用型鼠抗人ER单克隆抗体(产品编号为MAB-0062)、即用型兔抗人PR单克隆抗体(产品编号为RMA-0502)、即用型鼠抗人CerbB-2单克隆抗体(产品编号为MAB-0198)均购自福州迈新生物技术开发有限公司。SABC试剂盒、DAB显色试剂盒及PBS缓冲液结晶、柠檬酸修复液结晶均为Maixin-bio公司产品，购自武汉博士德生物工程有限公司。
　免疫组织化学染色方法
采用SABC 法，并设阳性、阴性对照。
　结果判定方法
　阳性染色反应分级判断标准
ER、PR为胞核着色，C-erbB-2为胞膜/胞浆着色。免疫组化染色结果判定参照邢传平等［3］相关文献：以低倍镜和高倍镜分别观察切片，阳性细胞为镜下组织细胞结构清晰，细胞浆或细胞核有棕黄色颗粒沉着，染色明显高于背景者。根据细胞百分率及染色深浅分级：1)阳性细胞百分率：无细胞显色为0分；25％的细胞显色为1分；25％～50％的细胞显色为2分；50％的细胞显色为3分。2)显色深浅不一或显色不清为0分；浅黄色为1分；棕黄色为2分；深褐色为3分。综和评分：0～1分为阴性(-)；2～3分为弱阳性(+)；4～5分为中度阳性(++)；5分为强阳性(+++)。ER、PR、C-erbB-2的免疫组化染色结果判定均参照以上标准。 本课题在进行数据处理时将+、 ++、+++合并为阳性(+)作统计分析。
　淋巴管判定及MLD计数方法
　淋巴管判定标准：在淋巴管内皮细胞胞膜和胞浆的D2-40阳性染色呈棕黄色颗粒状。标记阳性淋巴管一般呈扩张状，形态不规则，壁薄，管壁无平滑肌，管腔内偶见淋巴细胞，也可见由几个内皮细胞构成的细胞簇状，甚至仅见单个内皮细胞。
　计数方法：D2-40特异性地表达于淋巴管，参照Masakazu等［4］的方法对乳腺癌组织和癌旁正常乳腺组织MLD计数，把D2-40染色呈阳性着色的单个内皮细胞或内皮细胞簇分别计为一个阳性微淋巴管。乳腺癌组织先在低倍镜视野下分别选取肿瘤边缘(肿瘤浸润边缘区)和肿瘤中心区中脉管最丰富的区域，再在200倍视野下分别计数微淋巴管数目，每例计数3个视野，以其均值作为该病例MLD密度。癌旁正常乳腺组织选择阳性染色脉管最丰富区，在200倍视野下计数微淋巴管数目，每例计数3个视野，并求其均值。
　统计学处理
采用 统计软件对数据进行统计学处理。所有计量数据均以均数±标准差表示，显着性检验采用单因素方差分析或t检验。检验水准以为具有显着性差异；为具有非常显着性差异。
2 结果
　乳腺癌及癌旁正常乳腺组织中D2-40的表达
D2-40阳性染色仅定位于淋巴管内皮细胞胞膜和胞浆，呈棕黄色颗粒状(见图1)。癌旁正常乳腺组织中D2-40阳性染色淋巴管多呈扩张状，形态不规则，壁薄，管壁无平滑肌，管腔内偶见淋巴细胞，也可见呈闭锁的条索状或几个内皮细胞构成的细胞簇，甚至单个内皮细胞。乳腺癌组织内可见明确的D2-40阳性淋巴管(见图2～3)，也有部分乳腺癌组织内淋巴管相当稀疏甚至完全缺乏。乳腺癌组织中淋巴管数目和分布具有明显的异质性，表现为：①数目的差异：肿瘤边缘区中微淋巴管数最多(见图4)，MLD均值为±，肿瘤中心区MLD均值为±，肿瘤边缘区与肿瘤中心区MLD均值间差异有统计学意义；②形态的差异：肿瘤边缘区可以见到较多管腔扩张的淋巴管，而肿瘤中心区多为闭锁的条索状(见图5)。50例乳腺癌总的MLD均值为±，其相应癌旁正常乳腺组织MLD均值为±，两组MLD均值间差异有统计学意义，肿瘤边缘区MLD均值与癌旁正常乳腺组织差异有统计学意义，但肿瘤中心区MLD均值与癌旁正常组织差异无统计学意义，见表 1。表1癌旁正常乳腺、乳腺癌组织中淋巴管密度测定比较
　乳腺癌MLD与乳腺癌临床病理因素间的关系
50 例乳腺癌总的MLD与各临床病理因素间差异无统计学意义，乳腺癌不同区域的 MLD与各临床病理因素间差异有统计学意义，其中乳腺癌边缘区MLD与淋巴结转移、临床分期状态密切相关，伴淋巴结转移组，其肿瘤边缘区MLD与是否存在淋巴结转移间的差异有统计学意义；临床Ⅲ-Ⅳ期与临床Ⅰ-II期MLD比较：差异有统计学意义(P＜），见表2。
3 讨论
临床病理研究显示淋巴道转移是大多数实体瘤转移播散的早期事件，是肿瘤细胞转移的重要途径之一［5］。因此，开展肿瘤淋巴管研究，对阐明肿瘤淋巴道转移机制具有重要意义。D2-40抗体为新近发现的淋巴管内皮细胞特异标记物，本研究通过检测乳腺癌组织中D2-40的表达，计数MLD，并探讨乳腺癌组织MLD与淋巴结转移的关系及临床病理学意义。
　　目前关于实体肿瘤内是否存在新生淋巴管及淋巴管在人类肿瘤中存在怎样的作用等问题目前尚有争议。既往认为肿瘤内部呈高压状态，淋巴管难以存活，也无法侵入肿瘤内部。近年来，随着淋巴管内皮细胞特异标记物的发现，证实在多种肿瘤实验动物模型及少数人类肿瘤中发现有淋巴管存在［1,6～9］。本实验采用D2-40单克隆抗体对乳腺癌组织内的淋巴管所做标记显示，D2-40具有极高的特异性，仅表达于淋巴管内皮，而血管内皮未见表达，我们观察到乳腺癌组织内部及癌旁正常组织内均存在有淋巴管，通过对50例乳腺癌组织MLD计数，显示癌组织中MLD均值明显高于癌旁正常组织(P<)。且淋巴管分布具有异质性，乳腺癌组织不同区域微淋巴管数目有所不同，肿瘤边缘区MLD显着高于肿瘤中心区及癌旁正常组织，显示乳腺癌组织中淋巴管主要分布在肿瘤边缘区,同时形态有一定的差异，肿瘤边缘区的淋巴管分布较密集呈不同程度的扩张状态，而肿瘤中心区淋巴管分布较稀疏,多呈条索状。本实验证实了乳腺癌组织内有淋巴管的存在；并进一步证实了淋巴管分布、密度具有异质性，其主要分布在肿瘤边缘区。
肿瘤细胞经淋巴管转移至区域淋巴结是癌症进展的关键步骤。肿瘤内淋巴管的存在与肿瘤淋巴结转移是否相关，肿瘤组织MLD升高与肿瘤转移是否相关等问题是目前抗肿瘤治疗中极为重要而又亟待解决的问题。对于MLD与肿瘤淋巴结转移关系的研究相对较少，且结论不一致。［10］多数研究表明MLD与淋巴结转移密切相关。有学者对胃癌、乳腺癌、口咽部癌的研究显示，肿瘤内淋巴管密度与淋巴结转移显着相关［8，9，11］；有研究发现肿瘤组织内淋巴管仅由单层内皮细胞组成，内皮细胞间的连接不紧密，缺乏连续的基底膜；同时肿瘤组织间质液压强通常增高，使连接淋巴管内皮细胞和周围结缔组织的锚丝的张力增加，造成内皮细胞间的开放连接增多、间隙增大。正是这些特点，使淋巴管抵御肿瘤侵入的能力非常弱，为肿瘤细胞的转移提供了有利的通道。本研究显示乳腺癌不同区域MLD与淋巴结转移的关系有所差异，肿瘤中心区MLD与淋巴结转移之间无显着相关性，但是肿瘤边缘区MLD增加与淋巴结转移密切相关，提示肿瘤边缘区淋巴管可能对癌细胞扩散至周围淋巴结产生重要作用。同时，我们观察到乳腺癌中心区多数淋巴管呈闭锁的条索状，其原因可能为肿瘤细胞生长对周围淋巴管产生压力或直接侵入管腔，致其萎陷甚至溃破所致［12］。而肿瘤边缘区淋巴管呈不同程度的扩张状态，并有不同程度的破坏现象致使管壁通透性增高，加之癌周淋巴管呈低压强、低张力和大流量状态，适合肿瘤细胞的外渗和播散［13］，为癌转移提供了有利的条件，提示乳腺癌淋巴结转移可能主要是通过癌组织边缘区淋巴管实现的。因此乳腺癌边缘区MLD检测对判断其是否存在淋巴结转移可能具有意义。
进一步分析MLD与乳腺癌相关临床病理因素间的关系显示，肿瘤边缘区MLD与乳腺癌淋巴结转移、临床分期状态相关。肿瘤边缘区MLD伴淋巴结转移组与无淋巴结转移组间的差异有统计学意义(P<)；同时MLD在临床Ⅲ、Ⅳ期组明显高于临床Ⅰ、Ⅱ期组(P<)，结果表明MLD可能与肿瘤的侵袭力及转移程度有关。肿瘤的侵袭力强，其淋巴管更为丰富，使肿瘤细胞更易于经淋巴管进入淋巴结，并形成转移。肿瘤组织中MLD可以从一个侧面反映出肿瘤组织和肿瘤细胞微环境状态。随着肿瘤分期的进展，癌周组织内淋巴管数目不同程度增加，同时癌组织明显水肿，导致淋巴管扩张，使肿瘤细胞易于通过淋巴道转移［14］。转移是恶性肿瘤的重要特征，淋巴转移又是乳腺癌的主要途径，因此影响乳腺癌淋巴转移必然直接影响患者的预后状况。本实验由于时间较短，无法对患者的预后及生存率进行评估，是其不足之处。但本研究表明MLD与肿瘤分期、淋巴结转移存在相关性，MLD可影响乳腺癌的临床分期和淋巴结转移状况，而肿瘤的淋巴结转移又是重要的预后因素，因此MLD可被认为是推测乳腺癌预后的指标，本实验结果与部分文献报道基本一致。Sedivy等［15］对口腔鳞状细胞癌进行研究，表明MLD与肿瘤的分期。淋巴结转移状况相关；国内有人对非小细胞肺癌［16］、胰腺癌［17］的研究亦发现，MLD与肿瘤的淋巴结转移及临床分期相关。Valenca等［18］应用podoplanin染色研究恶性黑色素瘤，显示MLD是恶性黑色素瘤的预后因子，MLD高常预示患者的预后差，生存率低。
综上所述，乳腺癌组织中有淋巴管存在，且分布存在一定的异质性，肿瘤边缘区淋巴管数量的增加与肿瘤分期及淋巴结转移状态存在相关性，其MLD可作为乳腺癌预后的一项评估指标。
【参考文献】
［1］Skobe M,Hawighorst T, Jackson DG, et al. Induction of tumor lymphangiogenesis by VEGF-C promotes breast carcinoma　Med,2001,7:192-198
［2］ Padera TP, Kadambi A, Tomaso E, et al. Lymphatic metastasis in the absence of functional intratumor lymphatics. Science， 2002， 296: 1883-1886
［3］ 邢传平, 刘斌, 董亮.免疫组织化学标记结果的判断方法.中华病理学杂志，2001，30(4):318
［4］ Ohno Masakazu, Takeshi N, Yukihiro K, et al. Lymphagenesis correlates with expression of vascular endothelial growth factor-C in colorectal carcinoma. Oncology Reports， 2003,10: 939-943
［5］ He Y, Karpanen T, Alitalo K. Role of lymphangiogenic factors in tumor metastasis. Biochim Biophys Acta， 2004，1654:3-12
［6］ Karpanen T, Egeblad M, Karkkainen MJ, et al. Vascular endothelial growth factor C promotes tumor lymphangiogenesis and intralymphatic tumor growth. Carcinoma Res, 2001, 61:1786-1790
［7］ Mattila MM, Ruohola JK, Karpanen T, et al. VEGF-C induced lymphangiogenesis is associated with lymph node metastasis in orthotopic MCF-7 tumor. Int J Carcinoma, 2002, 98:946-951
［8］ Schoppmann SF, Birner P, Studer P, et al. Lymphatic microvessel density and lymphovascular invasion assessed by anti-podoplanin immunostaining in human breast carcinoma. Anti Carcinoma Res, 2001, 21:2351-2355
［9］Beasely NJ, Prevo R, Baneriji S, et al. Intratumoral lymphangiogenesis and lymph node metastasis in head and neck carcinoma. Carcinoma Res, 2002, 62:1315-1320
［10］ Sakuragi N, et al. A multivariate analysis of blood vessel and lymph vessel invasion as predictors of ovarian and lymph node metastases in patients with cervical carcinoma. Carcinoma，2000， 88(11):2578-2583
［11］ Atsuo shida，MD，Shuichi fujioka， Significance of Vascular Endothelial Growth Factor D in Gastric. Carcinoma World J Surg, 2005, 29:1600-1607
［12］Pepper MS .Lymphangiogenesis and tumor metasatis: myth or reality? Clin carcinoma Res ,2001,7:462-468
［13］ Kim H, Dumont DJ. Molecular mechanisms in lymphangiogenesis model systems and implications in human disease. Clin Genet,2003,64 :282-292
［14］ Li ZM Han JS Huang Y et al A novel gene deliverg system targeting cells expression VEGF Receptors［J］.Cell Res，1999，9(1) :11-25
［15］ Sedivy R, Beck-Mannagetta J, Haverkampf C, et al. Expression of vascular endothelial gowth factor-C correlates with the lymphatic microvessel density and the nodal status in oral squamous cell carcinoma. Carcinoma, 2003, 32(8):455-460
［16］ Dong X, Qiu XS, Wang EH, et al. Expression of vascular endothelial growth factor-C and VEGF receptor 3 in non-small cell lung carcinoma. Zhong hua Bing Li Xue Za Zhi, 2003 32(2):128-132
［１7］ 金刚，胡先贵，刘瑞.胰腺癌组织淋巴管分布及密度的临床病理学.中国医学科学报，2005,27 (5): 583-585
［1８］Valencak J,Heere-Ress E, Kopp T, et al. Selective immunohistochemical staining shows significant prognostic influence of lymphatic and blood vessel in patient with malignant melanoma. Eur J Carcinoma, 2004, 40(3):358-364